Dottorato in SCIENZE FARMACEUTICHE

Relazione attività di ricerca anno 2023-2024

Relazione attività di ricerca dottorandi iscritti al 39° ciclo:
Irene Arpante (Tutor: Prof.ssa Stefania Cesa)
Il frutto del melograno è noto per le sue proprietà nutrizionali, grazie al ricco profilo polifenolico presente sia nelle sue componenti edibili che non edibili. Gli arilli (50-60%) sono ricchi di antociani, i semi contengono il 12-20% di olio, composto per circa l'80% da acidi grassi coniugati, in particolare acido punicico, mentre le bucce (40-50%) sono abbondanti in ellagitannini [1]. Due cultivar di melograno autoctone del territorio di Avellino, gentilmente donate dall’azienda agricola Giovomel, sono state analizzate nella loro componente non edibile, al fine di valorizzare lo scarto. È stato valutato, attraverso l’estrazione idroalcolica (EtOH/H2O 5% CH3COOH 70:30) e successiva analisi quali-quantitativa HPLC-DAD, l'effetto del metodo di conservazione delle bucce sull’estrazione della componente ellagitannica. I risultati hanno dimostrato che le bucce liofilizzate preservano meglio la componente bioattiva. È stata ottimizzata un'estrazione idroalcolica senza acido per evitare interferenze nei saggi cellulari, seguita da una purificazione tramite estrazione in fase solida (SPE) per ridurre la componente zuccherina e concentrare i composti bioattivi. Gli estratti, arricchiti in punicalagina ed acido ellagico, sono stati testati per l'attività antiossidante in vitro (saggio DPPH) e in vivo su cellule HeLa e SHSY-5Y (saggio della Diclorofluoresceina), confermando una buona attività contro i radicali liberi. Parallelamente, dal residuo sul filtro, dopo l’estrazione idroalcolica delle bucce, è stata estratta la cellulosa con un buon rendimento e caratteristiche promettenti per future applicazioni come materiale rinnovabile e biodegradabile. Sono stati impiegati metodi eco-compatibili che evitano l’uso di solventi tossici (NaOH 1M, 4h a 45°C + NaClO 4% per 4-16h), in linea con i principi di sostenibilità ambientale. Infine, è stata condotta un'analisi colorimetrica CIEL*a*b* e HPLC-DAD su succhi commerciali di melograno, correlando il contenuto di antocianine con le proprietà cromatiche. I risultati suggeriscono che la colorimetria possa servire come indicatore rapido e non invasivo del contenuto di antocianine nei succhi.
Bibliografia
[1] Prakash, C. V. S., & Prakash, I. (2011). Bioactive chemical constituents from pomegranate (Punica granatum) juice, seed and peel-a review. International Journal of Research in Chemistry and Environment, 1(1), 1-18.

Roberta Astolfi (Tutor: Prof. Rino Ragno)
Durante il primo anno di dottorato, ho adottato un approccio multidisciplinare (estrattiva, microbiologia e machine learning) per studiare sostanze biologicamente attive di origine naturale e sintetica, focalizzando lo studio su miscele complesse come gli oli essenziali. Ho coordinato tesisti
nell'estrazione di oli essenziali tramite distillazione in corrente di vapore da diverse piante, sia naturali che coltivate, e ho contribuito all'arricchimento del database AI4EssOil, sviluppato dal nostro gruppo di ricerca per raccogliere informazioni sugli oli essenziali. Ho approfondito le tecniche di intelligenza artificiale, concentrandomi sul machine learning (ML) e deep learning, per i quali ho anche frequentato corsi di formazione specifici sul linguaggio Python applicato al ML. Con queste competenze, ho fatto da tutor nel corso di alta formazione in Bioinformatica, acquisendo ulteriori nozioni su statistica, linguaggi bash, R e applicazioni di intelligenza artificiale alla biologia molecolare. In una prima fase, ho completato il progetto di tesi applicando algoritmi di ML per analizzare l’attività antibatterica di oli essenziali contro Acinetobacter baumannii. Il modello ha identificato i composti chimici più influenti, successivamente acquistati e testati tramite saggi di macrodiluzione. I risultati di MIC e MBC sono stati confrontati con le previsioni del modello, dimostrandone l'elevata accuratezza. Ho sviluppato un altro modello ML per lo studio in silico dell'attività citotossica su fibroblasti 3T3- Swiss, validato tramite saggio MTT che ho svolto presso l’Università Cattolica di Roma. Ho applicato ulteriori modelli ML per analizzare l'attività antibatterica contro Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli e Aspergillus niger. Recentemente, ho avviato un progetto per valutare la capacità inibitoria di oli essenziali nei confronti dell'enzima Acetilcolinesterasi, che mi ha portato alla selezione di molecole singole che saranno motivo di future analisi tramite tecniche di chimica computazionale come 3D-QSAR e Docking. Tutti i modelli ML sviluppati sono stati pubblicati sul sito www.ai4essoil.com dove possono essere liberamente utilizzati.

Simone Bonacorsi (Tutor: Prof.ssa Daniela Secci)
In last decades, the interest in liposomes increased, spreading in several pharmaceutical applications. Indeed, liposomes are employed as controlled delivery systems, vaccine-adjuvants and detoxing agents.(1-3)
Despite the wide multitude of preparation approaches a well-controlled, robust, scalable and suitable to large-scale manufacturing method is still undeveloped. One of the most promising technique that allows obtaining monodisperse distribution of particles at desired size is microfluidics.(4) Despite the simplicity of the method several limitations such as low flow rates, microchip-dependency, scale-up strategy based on parallelization, confine it to laboratory scale, making it still unsuitable for industrial application.
This work has the purpose to overcome these limitations, increase the process productivity avoiding dependency from complex microchips, replacing the chip with cheaper and disposable off-the-shelf fittings (i.e. HPLC-fittings) and identify possible scale-up parameters.
For these purposes, a home-made system was assembled and used to produce empty liposomes of different composition (i.e. Doxil®, Marqibo®). The dependency of particle attributes (i.e. mean size and polydispersity, PDI) from the fluid dynamic parameter Reynolds number (Re) was investigated on different HPLC-fittings inner diameters (IDs) while other parameters were maintained constant (i.e. lipid concentration and aqueous/organic flow rate ratio). A dependency threshold (ReT) was observed in each tested ID fittings at specific Re, obtaining particles with desired attributes and reproducibility at Re > ReT, which flow is considered turbulent, while a loss of control of attributes was observed at Re ≤ ReT.
Finally, cfd studies using COMSOL Multiphysics® software were also conducted to characterize the fluid properties that lead to the product formation.
These findings encourage the evaluation of turbulent flows, simplifying the mixing architecture, utilizing ID and Re as scaling-parameter that allow the transfer from lab-scale to industrial sizes of high-quality product.
Bibliografia
(1) Allen TM, Martin FJ. Advantages of liposomal delivery systems for anthracyclines, Semin. Oncol. 2004, 31, 5–15. DOI: 10.1053/j.seminoncol
(2) Tretiakova DS, Vodovozova EL. Liposomes as Adjuvants and Vaccine Delivery Systems, Biochem. Suppl. Ser. A Membr. Cell Biol. 2022, 16, 1–20. DOI: 10.1134/S1990747822020076
(3) Damitz R, Chauhan A. Parenteral emulsions and liposomes to treat drug overdose, Adv. Drug Deliv. Rev. 2015, 90, 12–23. DOI: 10.1016/j.addr.2015.06.004
(4) Yu B, Lee RJ, Lee LJ, Microfluidic Methods for Production of Liposomes, Methods Enzymol. 2009, 465, 129-141. DOI: 10.1016/S0076- 6879(09)65007-2

Alessio Bruno (Tutor: Prof. Stefano Stranges)
Il mio progetto di ricerca ha l'obiettivo di sviluppare un metodo combinato, sperimentale e teorico, per il riconoscimento chirale. La mia attività sperimentale è incentrata sullo studio delle proprietà elettroniche di molecole chirali tramite la spettroscopia ARPES (Angle Resolved PhotoElectron Spectroscopy) utilizzando radiazione di sincrotrone.
Il lavoro beneficia delle previsioni teoriche ottenute da calcoli ab initio all'avanguardia, eseguiti presso l'Università di Trieste. Presso l'Università di Roma La Sapienza ho sintetizzato una molecola chirale non disponibile commercialmente: l’idrossimetil-tiirano (tiirano del glicidolo). La sintesi dei tiirani ad alta purezza enantiomerica permetterà di sviluppare modelli teorici affidabili per il calcolo del parametro dicroico e degli altri osservabili dinamici di fotoemissione.
La sintesi che ho condotto presso i laboratori della Sapienza ha portato alla formazione di idrossimetil tiirano con una purezza enantiomerica del 99% (eccesso enantiomerico: 98%), confermata dalla gascromatografia con fase stazionaria chirale. Dato il successo della sintesi sarà possibile cominciarecon le misure della sezione d'urto integrale, del parametro di anisotropia e del coefficiente dicroico per diversi canali di ionizzazione delle molecole gassose. In più sarà possibile caratterizzare la molecola con varie tecniche spettroscopiche vista la sua assenza in commercio e in letteratura.
Durante il mese di Maggio ho partecipato ad esperimenti di fotoionizzazione con luce di sincrotrone su campioni di cianoacetilene e bromuro di propargile, ed è stato importante per me acquisire esperienza con le tecniche spettroscopiche in fase gassosa che andranno applicate alla classe di tiirani che sto studiando. In parallelo ho lavorato all’analisi dei dati provenienti da esperimenti di fotoemissione sull’epicloridrina e il suo equivalente tiiranico, acquisendo quindi esperienza anche con il programma di analisi dati.
Bibliografia
(1) N. Böwering, et al., "Asymmetry in Photoelectron Emission from Chiral Molecules Induced by Circularly Polarized Light", Phys. Rev. Lett. 86, 1187 (2001).
(2) I. Powis, "Photoelectron circular dichroism of the randomly oriented chiral molecules glyceraldehyde and lactic acid", J. Chem. Phys., 112, 301-310, (2000).
(3) S. Stranges et al., "Valence photoionization dynamics in circular dichroism of chiral free molecules: The methyl-oxirane", J.Chem. Phys, 122, 244303 (2005).
(4) S. Turchini et al, "Circular dichroism in photoelectron spectroscopy of free chiral molecules: experiment and theory on methyl-oxirane", Phys. Rev. 70, 014502 (2004).(5) S. Daly, I. Powis, G. A. Garcia, H. Soldi-Lose, L. Nahon, "Photoionization of epichlorohydrin enantiomers and clusters studied with circularly polarized vacuum ultraviolet radiation", J. Chem. Phys. 134, 064306 (2011).
(6) T. A. Carlson et al., "Angle-resolved photoelectron spectroscopy of CCl4: The
(7) Cooper minimum in molecules", J. chem. Phys. 77, 5340 (1982).
(8) M. Fusè et al., "Anharmonic Aspects in Vibrational Circular Dichroism Spectra from 900 to 9000 cm−1 for Methyloxirane and Methylthiirane", J. Phys. Chem. A., 126, 6719-1733, (2022).
(9) L. Schio et al., "Photoionization dynamics of the tetraoxo complexes OsO4 and RuO4", Inorg. Chem., 59, 7274-7282, (2020).

Eleonora D’Intino (Tutor: Prof.ssa Carlotta Marianecci)
Nonostante i recenti progressi in campo oncologico, le terapie basate sulla chemioterapia presentano difficoltà dovute alla non specificità degli agenti chemioterapici che inibiscono non solo le cellule tumorali ma anche i tessuti sani a rapida crescita. Pertanto, è fondamentale l’identificazione di nuove strategie per massimizzare l’efficacia della chemioterapia con effetti collaterali minimi [1]. In tale contesto, i niosomi potrebbero rappresentare una strategia promettente in quanto sono in grado di intrappolare sia molecole lipofile che idrofile all’interno del bilayer o del core, rispettivamente, al fine di ottenere una concentrazione maggiore di farmaco veicolato all’interno delle cellule tumorali sfruttando l'effetto di permeabilità e ritenzione (EPR effect) e riducendo, così, gli effetti collaterali associati [2]. Tale progetto di Dottorato di Ricerca consiste nella formulazione di vescicole costituite da tensioattivi non ionici e colesterolo per la veicolazione dell’acido retinoico (ATRA). In particolare, si è scelto il Tween 21 come tensioattivo pH-sensibile ed il Tween 20 come tensioattivo non pH- sensibile. Tali nanocarrier sono stati ampiamente caratterizzati mediante l’utilizzo del Dynamic Light Scattering (DLS), spettrofotometro UV-visibile e analisi SAXS. Tutti i campioni sono stati sottoposti ad analisi di stabilità nel tempo, studi di rilascio e studi delle caratteristiche del bilayer. Inoltre, sono stati condotti studi in vitro su linee cellulari di carcinoma ovarico grazie alla collaborazione con l’Istituto Pasteur Italia. Parallelamente al progetto principale, ho anche effettuato una caratterizzazione con approccio multitecnica di due tipi di nanocarrier: soft e hard, rispettivamente niosomi e ferrofluidi (SPIONs) per una futura applicazione diagnostica o terapeutica. Inoltre, è stato condotto uno studio di formulazione e caratterizzazione di niosomi per la veicolazione di Gentamicina nel trattamento di infezioni del tratto urinario e di nanoemulsioni costituite di olio di lentisco per la veicolazione di levofloxacina. Tali sistemi sono stati ampiamente caratterizzati in termini chimico-fisici e grazie a studi in vitro.
Bibliografia
(1) Bashkeran T, Kamaruddin AH, Ngo TX, et al, Niosomes in cancer treatment: A focus on curcumin encapsulation, Heliyon, 2023, 9, e18710
(2) Sharifi M, Cho WC, Ansariesfahani A et al, An Updated Review on EPR-Based Solid Tumor Targeting Nanocarriers for Cancer Treatment, Cancers, 2022, 14, 2868

Giuseppe Esposito (Tutor: Prof. Daniela Secci, Co-tutor: Dott. Daniele Avitabile)
Lo scopo di questo progetto è quello di determinare il design e la produzione dei prototipi formulativi di una nuova compressa a base di cistina levogira, nella quale è stato sostituito il lattosio con un eccipiente alternativo.
La nuova formulazione, priva di lattosio, risponde all’esigenza di migliorare la compliance del paziente, nel caso di terapie prolungate quali quelle necessarie per il trattamento di patologie infiammatorie croniche come la psoriasi.
La sostituzione di un eccipiente all’interno di una preparazione farmaceutica è sempre un’azione delicata. Questo perché qualsiasi modifica nella composizione della forma farmaceutica può cambiare significativamente le proprietà fisiche, chimiche e farmaceutiche andando a modificare fattori critici per la sua sicurezza ed azione.
Oltre che per le problematiche sopracitate, la sostituzione del lattosio, seppur solo un eccipiente, comporta la necessità di svolgere studi approfonditi prima che il farmaco venga commercializzato.
Vi sono tuttavia eccipienti più conosciuti, già utilizzati, per cui gli studi non devono necessariamente sempre essere rinnovati totalmente.
L’International Pharmaceutical Excipeint Council (IPEC) ha classificato gli eccipienti in quattro classi basate sulle informazioni di sicurezza disponibili.
La quarta ed ultima classe di eccipienti classificati riguarda eccipienti già in uso, che non richiedono una valutazione della sicurezza ma studi approfonditi sulla biodisponibilità e l’ADME (Assorbimento-Distribuzione-Metabolismo-Escrezione).
A tal proposito, tra le diverse soluzioni disponibili sul mercato sono stati selezionati 4 eccipienti (Isomalto, Xilitolo, Cellulosa Microcristallina e Mannitolo) e realizzate delle prove formulative su scala ridotta a fine di sostituire il lattosio.
A partire dalla formula autorizzata AIFA del farmaco (Cistidil) è stata definita la composizione quali-quantitativa della compressa e definita la miscela idonea per la fase successiva di testing su un lotto pilota.

Doris Lacej (Tutor: Prof.Pietro Matricardi)
La Vitamina D e una vitamina essenziale per la salute ma che ha molti benefici anche sulla salute della pelle. Non esistono i gel o i emulsioni per
l’applicazione topica della vitamina D e abbiamo iniziato lavorare nelle formulazioni gel e emulsioni di diversi concentrazioni di olio di Vitamina D incorporato in un polimero con proprietà anfiliche. Il polimero utilizzato e un polimero nuovo PAAbCH, sintetizzato dall’ tradizionale poli-acrilico PAA aggiungendo la molecula del colesterolo CH che ha numerosi effetti positivi per la pelle. I emulsioni studiati sono preparati con due diverse concentrazione dell questo polimero PAAbCH, 0.5% e 0.25%. I emulsioni sono preparati in un metodo semi-industriale tranne miscelatore planetario - centrifugo.
La concentrazione della vitamina D olio, 10.000 UI utilizzato e stato 10%,20%,30% e 40% per ogni concentrazione di polimero e in totale abbiamo arrivato in 8 emulsioni diversi. Abbiamo studiato la granulometria e la stabilità accelerata dell'emulsioni . Dopo i primi risultati abbiamo studiato e analizzato le proprietà di reologie tranne reometro , analizzando i flow e frequency sweep.
Seconde le review , abbiamo analisato che sara interessante che nella formula finale di incorporare nell questo nuovo polimero la clindamicina che e un agente molto utilizzato per le infezione della pelle sopratutto per l’ acne. La combinazione della clindamicina con la vitamina D può avere molti vantaggi perché la vitamina D contribuisce a inibire l’infiammazione presente nell acne e nell stesso tempo idrata la pelle . Vitamina D contrasta
l'effetto disidratante della clindamicina e agisce in sinergia contro
propionibacterium acnes e l’infiamazione trattando le cause dietro le comparse dell acne. Abbiamo analizzato nella industria farmaceutica Profarma la API della clindamicina fosfate secondo la monografia dell ultima edizione della pharmacopeia EU , il assay e il profilo delImpurità tranne HPLC. Poi abbiamo iniziato analizzare la stabilita e le caratteristiche di reologie del polimero aggiungendo la clindamicina 1% e speriamo di andare avanti con altri analisi e studi nel stabilire una formulazione stabile.

Arianna Speroni (Tutor: Francesca Ghirga)
1. Identificazione di un nuovo target biologico: KPC3. KPC3 è una carbapenemasi di classe A ampiamente diffuso al livello globale e in grado di idrolizzare una grande varietà di antibiotici β-lattamici. Lo scopo di questo lavoro è l’identificazione di nuove molecole in grado di inibirne l’attività agendo da coadiuvanti di antibiotici già esistenti, come carbapenemi e ceftazidine. Una libreria in-house, catalogata e convertita in versione informatica, è stata aggiornata per essere sottoposta a virtual screening rispetto alla struttura cristallografica dell’enzima KPC3. I composti individuati come virtual hits dagli studi computazionali sono stati sottoposti a test di purezza tramite H NMR. Inoltre, sono stati condotti studi di solubilità in solventi compatibili con gli studi biologici e i campioni sono stati preparati per essere sottoposti a saggi biochimici e microbiologici.
2. Sintesi di derivati di PD-1 come inibitori di ArnT. Questo progetto si è focalizzato sull’identificazione di inibitori dell’enzima ArnT coinvolto nel meccanismo della resistenza alla colistina in batteri Gram-negativi. In uno studio precedente, il composto PD-2 è risultato promettente come agente adiuvante della colistina. In questa prima fase del progetto di ricerca, il composto PD-2 è stato sottoposto ad un ciclo di disegno-sintesi-test biologici con lo scopo di aumentare la capacità coadiuvante la colistina e rifinire le relazioni struttura- attività (SARs). Con questo scopo, è stata disegnata una piccola libreria di derivati azotati di PD-1, di tipo ammidico e amminico. In seguito, è stata condotta una ricerca bibliografica e sono state eseguite diverse procedure per mettere a punto una strategia sintetica efficiente in termini di resa, costi e tempi, per la preparazione dell’ammide primaria PDA, composto chiave di questa nuova generazione di composti, e dei suoi derivati ammidici e amminici. Attualmente su tutti i composti sintetizzati sono in corso studi biologici finalizzati alla valutazione della loro attività biologica.
Bibliografia
(1) Petrou V. et al., Science 2016, 351, 608−612.
(2) Quaglio, D. et al., J. Org. Chem. 2020, 85, 16, 10891–10901.
 
 
Relazione attività di ricerca dottorandi iscritti al 38° ciclo:
Barbara Bigi (Tutor: Prof.ssa Stefania Petralito)
Una linea di ricerca è stata focalizzata sulla preparazione e caratterizzazione di nanoemulsioni (NE) olio-in-acqua a base di olio essenziale (OE) di Origanum vulgare con nanoparticelle d'argento (AgNPs) all'interfaccia [1,2], per potenziare l'azione antimicotica dell’OE emulsionato attraverso la nota attività biocida delle AgNPs. Sono state preparate NE lipidiche tramite tecnica del solvent displacement, utilizzando fosfatidilcolina di soia (SPC) come tensioattivo e benzalconio cloruro (BK), acido fenilacetico (PAA) e alcol benzilico (BA) come co-tensioattivi, non lipidici, in rapporto ponderale 20:1. Le NE ottenute sono state caratterizzate per dimensione, indice di polidispersione e potenziale zeta con Dynamic Light Scattering. La gas
cromatografia/spettrometria di massa e l’analisi dello spazio di testa hanno permesso una valutazione quali-quantitativa della composizione chimica dell'OE, prima e dopo la sua formulazione in NE. Ciascuna NE è stata addizionata con AgNO₃ per ottenere AgNPs mediante sintesi biogenica. Alcune preparazioni sono state addizionate con estratto di buccia di melograno come ulteriore agente riducente. La formulazione più promettente, in termini di stabilità e numero di AgNPs, conteneva il co-tensioattivo cationico. L’analisi dimensionale suggerisce che le gocce oleose siano “decorate” da AgNPs. In aggiunta, un altro ambito di ricerca riguarda la preparazione di sistemi ibridi hydrogel contenenti nanoparticelle magnetiche, responsivi a campi magnetici statici. Utilizzando gelatina e gelatina metacrilata, è stato preparato un network polimerico variando la concentrazione (6%, 12%, 18% p/V) e il tipo di reticolazione (fisica o chimica), al cui interno è avvenuta la formazione di nanoparticelle magnetiche per co-precipitazione in situ. I sistemi ottenuti sono stati caratterizzati per capacità di rigonfiamento e rilascio di vitamina B12, con o senza nanoparticelle magnetiche e con applicazione di campo magnetico statico pari a circa 40 mT. I risultati preliminari indicano un rilascio controllato e più rapido sotto azione di campo magnetico, aprendo la strada a sistemi intelligenti per il rilascio di farmaci.

Alessia Di Noi (Tutor: Prof.ssa Anna Troiani)
L’attività di ricerca svolta durante il secondo anno di Dottorato ha riguardato, in una prima parte, la conclusione di un progetto relativo alla caratterizzazione di campioni di origano allo scopo di evidenziare la possibile presenza di adulteranti mediante spettrometria di massa AP-MALDI. I dati relativi al fingerprint acquisito sia in modalità di ioni positivi che negativi, sono stati sottoposti ad analisi multivariata Partial least square discriminant analysis (PLS-DA). Il modello di previsione così ottenuto si è dimostrato in grado di distinguere tra gruppi tipici (origano autentico) e atipici (origano adulterato), performando meglio in modalità di ioni negativi.
Un secondo progetto, svolto preso l’Università tecnica di Vienna (TU Wien), ha riguardato la rivelazione di glucosio e di suoi metaboliti in campioni di pelle e in skin equivalents in relazione ai processi di invecchiamento, mediante l’impiego della spettrometria di massa MALDI Imaging (MSI). Infatti, nei cheratinociti di pazienti geriatrici è stato osservato un aumento dei livelli globali di glucosio a causa della riduzione dell'attività della glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD), enzima responsabile del primo step metabolico del glucosio nell'epidermide. Dunque, la rivelazione e localizzazione del glucosio e dei suoi metaboliti fornisce importanti informazioni sui processi di invecchiamento della pelle. Come matrice è stata utilizzata la n-(1-naftil) etilendiammina diidrocloruro (NEDC), depositata sui campioni fresh frozen mediante sublimazione in vuoto. Le acquisizioni sono state effettuate con uno spettrometro FT-ICR MALDI in modalità negativa nell'intervallo di massa 42-1200 m/z e con elevata risoluzione spaziale. Sono state ottenute immagini relative alla distribuzione nell’epidermide di glucosio clorurato (m/z =215.03276), di suoi metaboliti cosiddetti high energy e di lipidi in sezioni consecutive di biopsie umane e in skin equivalents. L’annotazione delle specie è stata effettuata mediante consulto di molteplici database online ottenendo un numero significativo di specie rilevate con un errore < 1 ppm.

Emanuele Fabbrizi (Tutor: Prof. Antonello Mai)
SIRT6, a key NAD+-dependent enzyme, has gained substantial attention for its role in various cellular processes, including DNA damage repair, metabolic regulation, and apoptosis. As a lysine deacetylase, deacylase, and mono-ADP-ribosyltransferase, SIRT6 participates in diverse signaling pathways that influence a wide range of physiological and pathological conditions, such as aging, metabolism, neurodegeneration, and cardiovascular diseases like atherosclerosis and heart failure.
Notably, SIRT6 modulates the expression and activity of both pro-apoptotic (e.g., Bax) and anti-apoptotic factors (e.g., Bcl-2, survivin), revealing its complex role in cancer. Due to SIRT6's involvement in both tumor suppression and progression, developing inhibitors targeting this enzyme could pave the way for new anticancer therapies and further exploration of its biology [1,2].
Our study focused on developing novel SIRT6 inhibitors. Using protein crystallography to screen a fragment library, we designed compounds by merging optimal fragments with linkers, identifying new scaffolds for SIRT6 inhibition. This led to the discovery of compound S6023, which exhibited micromolar activity (IC50 = 5 μM) and selectively inhibited SIRT6 in W138 cells, increasing levels of the senescence marker p21.
To enhance S6023's potency, we synthesized over 30 analogues, identifying MC4637. Co-crystal structures revealed a similar binding mode to S6023, and MC4637 demonstrated submicromolar activity (IC50 = 600 nM) in enzymatic assays. MC4637 also selectively inhibited SIRT6 without affecting other SIRT isoforms and increased histone acetylation levels of H3K9 and H3K18 in HEK T273 cells, confirming its potential as a SIRT6 inhibitor with therapeutic applications.
Bibliografia
(1) Fiorentino F, Mai A, Rotili D. Emerging Therapeutic Potential of SIRT6 Modulators. J Med Chem. 2021 Jul 22;64(14):9732-9758. doi: 10.1021/acs.jmedchem.1c00601. Epub 2021 Jul 2. PMID: 34213345; PMCID: PMC8389836.
(2) Fiorentino F, Carafa V, Favale G, Altucci L, Mai A, Rotili D. The Two-Faced Role of SIRT6 in Cancer. Cancers (Basel). 2021 Mar 8;13(5):1156. doi: 10.3390/cancers13051156. PMID: 33800266; PMCID: PMC7962659.

Miriana Radicchi (Tutor: Prof.ssa Deborah Quaglio)
La via di trasduzione del segnale di Hedgehog (Hh) rappresenta una delle principali vie molecolari oncogeniche, dal momento che la sua aberrante attivazione indotta da mutazioni nei suoi regolatori (Ptch, Smo, Sufu, Gli1, e Gli2) causa o promuove i meccanismi di tumorigenesi di diversi tumori umani, quali il carcinoma basocellulare, il medulloblastoma e la leucemia mieloide acuta.1,2 Di conseguenza, la via di Hh è emersa come un promettente target terapeutico per il trattamento di un ampio numero di tumori e sono stati progettati diversi inibitori di Hh come antagonisti del recettore Smo. Tuttavia, l’insorgenza di fenomeni di farmaco-resistenza, dovuta per lo più all’instaurarsi di mutazioni a carico del recettore Smo, ha indirizzato la comunità scientifica verso la ricerca di strade alternative.3 Nel 2014 il gruppo di ricerca del prof. Botta ha identificato l’isoflavone naturale Glabrescione B quale promettente inibitore di Gli1.4 Al fine di identificare i requisiti strutturali chiave del nucleo isoflavonico del GlaB per l’inibizione di Gli1, sono stati condotti studi sulla velocità di rilassamento monoselettiva (Rms) dei protoni del GlaB in presenza di Gli1, evidenziando il ruolo chiave dell’anello B nell’interazione.5 Con lo scopo di valutare se la rimozione dell’anello C del nucleo isoflavonico del GlaB possa influenzare l’attività inibitoria nei confronti di Gli1, è stato sintetizzato il corrispondente deossibenzoino del GlaB (deox_GlaB), quale prodotto di riduzione dell’anello C del nucleo isoflavonico, con formazione di un nuovo centro stereogenico sull’atomo di carbonio in posizione α rispetto al carbonio carbonilico. Di conseguenza, per mettere a punto una metodologia sintetica volta all’ottenimento dei singoli stereoisomeri del deox_GlaB, sono stati condotti studi di α-alchilazione enantioselettiva sul substrato modello 1,2-difeniletan-1-one utilizzando diversi agenti alchilanti. Per promuovere l’induzione asimmetrica nel processo di α-alchilazione è stato impiegato l’ausiliario chirale N-ammino ossazolidinone.6 I derivati sintetici ottenuti sono stati esaminati mediante HPLC per valutare l’eccesso enantiomerico.
Bibliografia
1 Nüsslein-Volhard, C.; Wieschaus, E. Mutations Affecting Segment Number and Polarity in Drosophila. Nature 1980, 287 (5785), 795–801. https://doi.org/10.1038/287795a0.
2 Chiang, C.; Litingtung, Y.; Lee, E.; Young, K. E.; Corden, J. L.; Westphal, H.; Beachy, P. A. Cyclopia and Defective Axial Patterning in Mice LackingSonic Hedgehog Gene Function. Nature 1996, 383 (6599), 407–413. https://doi.org/10.1038/383407a0.
3 a) Lipinski, R. J.; Hutson, P. R.; Hannam, P. W.; Nydza, R. J.; Washington, I. M.; Moore, R. W.; Girdaukas, G. G.; Peterson, R. E.; Bushman, W. Dose- and Route-Dependent Teratogenicity, Toxicity, and Pharmacokinetic Profiles of the Hedgehog Signaling Antagonist Cyclopamine in the Mouse. Toxicological Sciences 2008, 104 (1), 189–197. https://doi.org/10.1093/toxsci/kfn076. b) Yauch, R. L.; Dijkgraaf, G. J. P.; Alicke, B.; Januario, T.; Ahn, C. P.; Holcomb, T.; Pujara, K.; Stinson, J.; Callahan, C. A.; Tang, T.; Bazan, J. F.; Kan, Z.; Seshagiri, S.; Hann, C. L.; Gould, S. E.; Low, J. A.; Rudin, C. M.; de Sauvage, F. J. Smoothened Mutation Confers Resistance to a Hedgehog Pathway Inhibitor in Medulloblastoma. Science (1979) 2009, 326 (5952), 572–574. https://doi.org/10.1126/science.1179386. c) Lauth, M.; Bergström, Åsa; Shimokawa, T.; Toftgård, R. Inhibition of GLI-Mediated Transcription and Tumor Cell Growth by Small-Molecule Antagonists. Proceedings of the National Academy of Sciences 2007, 104 (20), 8455–8460. https://doi.org/10.1073/pnas.0609699104.
4 Infante, P.; Alfonsi, R.; Botta, B.; Mori, M.; Di Marcotullio, L. Targeting GLI Factors to Inhibit the Hedgehog Pathway. Trends Pharmacol Sci 2015, 36 (8), 547–558. https://doi.org/10.1016/j.tips.2015.05.006.
5 Infante, P.; Mori, M.; Alfonsi, R.; Ghirga, F.; Aiello, F.; Toscano, S.; Ingallina, C.; Siler, M.; Cucchi, D.; Po, A.; Miele, E.; D’Amico, D.; Canettieri, G.; De
Smaele, E.; Ferretti, E.; Screpanti, I.; Uccello Barretta, G.; Botta, M.; Botta, B.; Gulino, A.; Di Marcotullio, L. Gli1/
DNA
 Interaction Is a Druggable Target
for Hedgehog‐dependent Tumors. EMBO J 2015, 34 (2), 200–217. https://doi.org/10.15252/embj.201489213.
6 Huynh, U.; McDonald, S. L.; Lim, D.; Uddin, Md. N.; Wengryniuk, S. E.; Dey, S.; Coltart, D. M. Formation, Alkylation, and Hydrolysis of Chiral Nonracemic N -Amino Cyclic Carbamate Hydrazones: An Approach to the Enantioselective α-Alkylation of Ketones. J Org Chem 2018, 83 (21), 12951– 12964. https://doi.org/10.1021/acs.joc.8b00655.

Mariya Ryzhuk (Tutor: Prof.ssa Francesca Ghirga)
Uno dei meccanismi che permette ai batteri Gram-negativi di acquisire resistenza alla colistina è la glicosilazione del lipide A, catalizzata dall’enzima ArnT1. Studi precedenti hanno permesso l’identificazione del diterpene naturale “ent-beyer-15-en-18-ossalato”, FDO, quale composto più promettente nell’inibizione di ArnT2.
Con lo scopo di effettuare una semplificazione della struttura base ent-beyer diterpenica dell’hit compound è stata disegnata e sottoposta a screening rispetto alla struttura cristallografica di ArnT una libreria di composti a struttura abietanica, derivati dagli acidi abietico, deidroabietico e podocarpico. Questi composti presentano i vantaggi di essere commercialmente disponibili e di essere caratterizzati dalla presenza di insaturazioni che ne permettono l’analisi mediante HPLC.
Dai test preliminari è emersa la capacità del podocarpolo (PD2) di causare, in associazione con la colistina, la riduzione della crescita batterica in modo dose-dipendente. Al fine di aumentare la capacità coadiuvante l’azione della colistina del composto PD2 e di definire la SAR, è stata disegnata una serie di derivati del composto PD2. In accordo con la SAR precedentemente definita per FDO, la funzione alcolica (C-12) del podocarpolo è stata modificata chimicamente. In particolare, sono state investigate le seguenti caratteristiche strutturali:
• la presenza della funzione ossalica responsabile dell’attività di FDO;
• la lunghezza e la flessibilità della catena alchilica del gruppo funzionale legato in posizione C-16;
• la presenza di un’unità zuccherina per mimare L-Ara4N;
• il ruolo della funzione fenolica in posizione C-12.
Attualmente tutti questi derivati sono in fase di valutazione biologica al fine di verificarne la capacità di potenziare l’attività della colistina in ceppi resistenti di Pseudomonas aeruginosa.
Bibliografia
(1) Lo Sciuto A., Imperi F., Aminoarabinosylation of Lipid A Is Critical for the Development of Colistin Resistance in Pseudomonas aeruginosa, Antimicrob Agents Chemother., 2018, 62, e01820-17.
(2) Quaglio D., et al., ent-Beyerane Diterpenes as a Key Platform for the Development of ArnT-Mediated Colistin Resistance Inhibitors, J. Org. Chem., 2020, 85, 10891–10901.

Benedetta Salvucci (Tutor: Prof.ssa Mariangela Biava)
Nonostante i recenti progressi nello sviluppo di terapie promettenti per il trattamento della tubercolosi, il trattamento delle infezioni causate da micobatteri non tubercolari (NTM) continua a rappresentare una grave emergenza sanitaria. Tra questi, Mycobacterium abscessus (Mab) si distingue per la scarsa risposta ai trattamenti a causa dell'elevata resistenza farmacologica ai principali antibiotici. Mab è un patogeno opportunistico che principalmente causa infezioni polmonari, specialmente nei pazienti immunocompromessi. L'aumento delle infezioni causate da Mab sottolinea
l’urgente necessità di comprendere le sue interazioni chimico-genetiche sia in colture axeniche che in condizioni host-like. Lo scopo di questo studio, svolto nei laboratori del professor Eric J. Rubin presso la Harvard T.H. Chan School of Public Health, è identificare nuovi target terapeutici al fine di migliorare l'efficacia degli antibiotici esistenti e di nuovi composti. In particolare, lo studio ha mirato a individuare geni critici in ambienti fisiologici rispetto a quelli identificati in medium di coltura standard. Per simulare l'ambiente fisiologico polmonare, abbiamo sviluppato un modello in vitro utilizzando il medium di coltura air-liquid interface (ALI) [1]. Successivamente, sono stati valutati due composti: SQ109, un promettente candidato in fase di sperimentazione clinica per il trattamento della tubercolosi farmaco-resistente, e la bedaquilina, un nuovo agente antitubercolare, impiegato nel trattamento della tubercolosi multi-farmaco-resistente (MDR-TB). Entrambi i composti hanno mostrato buoni valori di Minima Concentrazione Inibente (MIC) nel modello ALI. Abbiamo, poi, eseguito un transposon mutagenesis and sequencing screen (Tn-Seq) con l'obiettivo di identificare geni essenziali per la crescita in vitro [2]. Questo approccio è finalizzato alla scoperta di potenziali target terapeutici per migliorare le strategie di trattamento contro Mab, rispondendo così alla crescente minaccia rappresentata da questo patogeno.
References
[1] Sullivan, M.R., et al., Biotin-dependent cell envelope remodelling is required for Mycobacterium abscessus survival in lung infection. Nat Microbiol, 2023
[2] DeJesus, M.A., et al., Comprehensive Essentiality Analysis of the Mycobacterium tuberculosis Genome via Saturating Transposon Mutagenesis. mBio, 2017

Alessandro Semeraro (Tutor: Prof. Giancarlo Fabrizi)
Nel corso dell’anno accademico 2023/2024, ho condotto un’ampia gamma di attività di ricerca focalizzate su intelligenza artificiale e sostenibilità agro- alimentare. Una parte significativa del lavoro ha riguardato la caratterizzazione dei composti C8 e C21, per i quali abbiamo ottenuto derivati attraverso Ligand Designer e calcoli di FEP utilizzando il software Biovia. Questi studi hanno permesso di valutare la stabilità e l’efficacia dei derivati come potenziali inibitori della proteina Nek6, legata alla proliferazione tumorale. Parallelamente, ho utilizzato l’intelligenza artificiale per identificare nuovi inibitori di Nek6, impiegando algoritmi di Machine Learning per ridurre tempi e costi di screening. Questo approccio è stato ulteriormente potenziato dallo sviluppo di un filtro molecolare in Python, che ha ottimizzato la selezione di composti con potenziale attività biologica. Le simulazioni di dinamiche molecolari dei complessi C8 e C21, condotte con Biovia, e il consensus docking tra Schrodinger e Biovia hanno rafforzato i nostri risultati e migliorato la comprensione delle interazioni molecolari.
Nel contesto della sostenibilità agro-alimentare, ho partecipato a eventi e seminari, approfondendo le mie compettenze. Un altro progetto significativo ha riguar dato l’uso di MATLAB per analizzare diversi metodi di stoccaggio di mele, valutando l’efficacia nel mantenimento della qualità del prodotto. Infine, abbiamo esplorato lo screening virtuale di librerie di molecole naturali di interesse per l’Agritech, identificando composti attivi su proteine coinvolte nella proliferazione tumorale. Queste iniziative evidenziano i nostri principali progressi e contributi scientifici dell’anno, mostrando un impegno continuo verso l’innovazione nelle scienze della vita e la sostenibilità.
 
Relazione attività di ricerca dottorandi iscritti al 37° ciclo:
Giorgio Buttitta (Tutor: Prof.ssa Daniela Secci)
Delivering drugs to the central nervous system (CNS) remains a formidable challenge due to several factors: (i) incomplete understanding of brain functions; (ii) off-target effects, with CNS drugs often exhibiting unintended activity beyond the target site; (iii) discrepancies between pre-clinical predictions and clinical outcomes, as many CNS drugs display differing efficacy and safety profiles in clinical settings; (iv) the critical role of transporters, which influence CNS drug delivery more profoundly than in other tissues; and (v) the lack of integrative approaches addressing these multifaceted challenges. Our project, "Development of a Lipid-Based Brain Delivery Platform for the Vehiculation of New Synthetic MAO Inhibitors," adopts an interdisciplinary strategy to overcome these barriers. By combining a novel synthetic monoamine oxidase (MAO) inhibitor with an innovative drug delivery methodology, the study seeks to address a central hurdle in neuropharmacology: efficiently crossing the blood-brain barrier (BBB).
To date, our efforts have centered on the synthesis and optimization of the active compound, alongside the rational design of the liposomal formulation. Using a Design of Experiment (DoE) methodology integrated with microfluidics, we have developed highly pegylated small liposomes (<100 nm). These formulations have demonstrated promising encapsulation efficiency (EE%), as quantified by High-Performance Liquid Chromatography (HPLC). Morphological characterization via cryogenic Transmission Electron Microscopy (cryo-TEM) has confirmed structural integrity, while Multi-Angle Dynamic Light Scattering (MADLS) has provided critical insights into particle size, zeta potential, and concentration. Stability studies have also been conducted extensively, under both storage and biorelevant conditions, revealing the robustness of the formulation.
Future research will focus on conducting in vitro studies using relevant cellular models to evaluate toxicity and efficacy for both the naked compound and the optimized liposomal formulation. Furthermore, scaling up production and performing in vivo studies will be essential steps to validate the formulation's ability to cross the BBB and achieve therapeutic efficacy at the CNS level. These efforts aim to bridge the gap between pre-clinical research and translational applications, contributing to the advancement of effective therapies for CNS disorders.
Vito Cosimo Carriero (Tutor: Prof.ssa Maria Antonietta Casadei)
Durante questo anno sono state condotte attività di ricerca finalizzate alla produzione di scaffold polimerici idonei alla rigenerazione ossea. A tale scopo sono state realizzate matrici di tipo criogel usando derivati metacrilici di gelatina (GelMA) [2] o condroitina solfato (CSMA) [3], arricchite con idrossiapatite (HA) [1]. La fabbricazione dei criogel è stata ottimizzata confrontando cristalli di HA irregolari [4], prodotti in laboratorio, e cristalli di HA commerciali di forma sferica.
In prima istanza è stata testata la stabilità delle sospensioni di HA in soluzioni al 6% p/v di CSMA, GelMAA e GelMAB. Da tali indagini è emerso che la CSMA e la GelMAB sono in grado di prevenire efficacemente la sedimentazione dell’HA. Al contrario, la GelMAA è in grado di stabilizzare solo sospensioni di HA a bassa concentrazione e dopo opportuna modifica del pH. Il diverso comportamento dei polimeri investigati è probabilmente da ricondursi alle diverse cariche elettriche presenti sulle catene.
A partire da queste indagini preliminari, è stata determinata la quantità di HA da utilizzare per la preparazione di criogel omogenei. I sistemi prodotti nelle condizioni ottimizzate sono stati poi caratterizzati sistematicamente e confrontati con i rispettivi sistemi privi di HA. Da tali caratterizzazioni è emerso che l’aggiunta di HA non influenza né la capacità di assorbire soluzioni fisiologiche né l’architettura interna porosa. In maniera parziale, invece, l’HA altera la distribuzione dimensionale dei pori, come emerso dalle indagini di microscopia elettronica a scansione, e le proprietà meccaniche delle matrici. Nonostante la bassa quantità impiegata, l’HA influenza la resistenza alla compressione dei sistemi, che risulta parzialmente incrementata nei criogel a base di GelMAB e CSMA arricchiti da HA regolare e parzialmente ridotta in tutti i sistemi arricchiti da HA irregolare.
Ulteriori studi esploreranno l'effetto della concentrazione di cristalli sulle proprietà meccaniche e l’efficacia osteoinduttiva in vitro per l'applicazione nella rigenerazione tissutale.
Bibliografia
(1) Carriero, V.C. et al., Gels 2023, 9, 979.
(2) Di Muzio, L. et al., Eur. Polym. J. 2021, 154, 110538.
(3) Di Muzio, L. et al., Carbohydr. Polym. 2022, 296, 119916.
(4) Cao, L. et al. Ceramics International 2005, 31, 1041–1044.

Carola Castiello (Tutor: Prof. Dante Rotili)
Le Sirtuine sono istone-deacetilasi appartenenti alla classe III delle HDAC che lavorano con un meccanismo NAD+ dipendente.(1) Sono coinvolte in molti processi fisiologici e patologici, compresi l’invecchiamento, le malattie cardiache e i disordini metabolici.(2) Viste le numerose evidenze scientifiche riguardo il ruolo cardioprotettivo delle sirtuine nell’ischemia/reperfusion injury (IRI) cardiaca,(3,4,5) abbiamo iniziato una collaborazione con il gruppo di ricerca della prof Joanna Andreadou ad Atene. Dopo aver selezionato e testato sia in vitro che in vivo tre composti attivanti le SIRT precedentemente sintetizzati nel laboratorio di Roma (MC2606, MC2789 e MC3215), selettivi su SIRT1, SIRT3 e SIRT5 rispettivamente,(6) al fine di indagare il loro potenziale cardioprotettivo nell’IRI, abbiamo deciso di effettuare ulteriori saggi solo con l’attivatore di SIRT5 (MC3215), rivelatosi il più promettente. Attraverso analisi Western Blot è stato valutato il potenziale cardioprotettivo di MC3215, che attiva sia meccanismi metabolici (β- ossidazione), che i classici meccanismi di cardioprotezione (RISK). Inoltre, preserva le funzioni mitocondriali, incrementando la fusione mitocondriale, ed assicura una sostenuta produzione di energia per sostenere il cuore durante il danno ischemico.
Il technology transfer ha lo scopo di assicurare la riproducibilità, la robustezza, la qualità e la sicurezza di un processo produttivo quando questo viene trasferito da un’azienda farmaceutica ad un’altra.(7) In questo caso, mi sono occupata del transfer all’azienda ITC Production riguardante la specialità medicinale in compresse rivestite a base di Lofepramina HCl. Sono state svolte tutte le attività di controllo del rischio, dalla produzione sia in scala prototipale nel laboratorio R&D, sia in scala industriale, al fine di assicurare la qualità del prodotto finale e mitigare i rischi durante lo scale-up industriale. Attraverso l’utilizzo di impianti come il letto fluido e la comprimitrice, sono state svolte inizialmente delle prove tecnologiche per poi passare alla produzione del Feasibility Batch, volto a valutare la fattibilità della produzione su scala industriale.

Michele Coluccia (Tutor: Prof.ssa Daniela Secci)
L’attività di ricerca svolta durante l’anno accademico 2023/2024 ha compreso, oltre alla normale attività svolta presso il dipartimento, anche
un’esperienza di sei mesi, da marzo ad agosto 2024, presso il reparto R&D (e in misura minore presso il laboratorio QC) dell’azienda farmaceutica ITC Production, presso Pomezia. Per quanto riguarda l’attività svolta in dipartimento, in continuazione con quanto svolto l’anno precedente, sono state sviluppate diverse serie di composti a struttura benzofuranica attivi come inibitori nei confronti delle monoamino ossidasi umane, nello specifico verso l’isoforma B, ampiamente coinvolta nei processi patogenetici di diverse malattie neurodegenerative come Parkinson e Alzheimer1. Le serie sviluppate presentano una struttura 5 o 6-nitrobenzufuranica e sono state ottenute mediante semplici sintesi one-pot. A partire da queste due serie, tramite una riduzione ottenuta utilizzando polvere di ferro ridotto, sono state ottenute le corrispettive serie ridotte, caratterizzate quindi dalla presenza del gruppo aminico in posizione 5 o 6 della struttura benzofuranica. Una importante novità nel mio lavoro di ricerca è stata la messa a punto del protocollo sperimentale per la conduzione di saggi di inibizione enzimatica per valutare l’attività in vitro dei composti sintetizzati. I composti saggiati hanno quasi tutti riportato una attività preliminare ottima e sono in attesa di essere ulteriormente valutati.
Nel periodo svolto presso l’azienda ITC Production, mi sono occupato di sviluppo e validazione di metodi analitici per HPLC, technology transfer per i nuovi progetti e ottimizzazione di processo per prodotti già esistenti. Nello specifico, ho avuto modo di partecipare allo sviluppo di un medicinale equivalente veterinario, sia per quanto riguarda la parte formulativa e produttiva che per la parte analitica, sviluppare un metodo analitico per l’analisi del sodio gentisato come agente conservante in uno sciroppo con prometazina e sviluppare un metodo analitico per l’analisi del diclofenac potassico in un medicinale prodotto nello stabilimento.
Bibliografia
(1) Yi C, Liu X, Chen K, Liang H, Jin C.. Eur J Med Chem. 2023;252

Michele D’Ambrosio (Tutor: Prof. Romano Silvestri)
Having spent most of my third year abroad at the University of Pennsylvania, the focus of my project was on the synthesis of new (+)-Discodermolide (DDM) congeners. During this period, I worked under the supervision of Prof. Amos B. Smith III, who is well known in the chemistry field for his research on natural products. The Smith group has a solid experience in the ex-novo syntheses of natural compounds, such as DDM, as reported by its numerous publications [1-4]. The DDM is a stabilizer of microtubules, essential constituents of cell cytoskeleton, and has many biological activities, namely immunosuppressive and antiproliferative properties, it induces an accelerated senescence and can be used in synergy with paclitaxel as a combination therapy [5]. Given these characteristics, the aim of the project was synthetizing new analogues of this compound, modifying some parts of the molecule, specifically the lactone moiety, and the conversion of the diene to a monoene. To ensure this goal, the ideal chemical route to carry out started from the construction of a common precursor, used to obtain three different fragments, that would have been coupled at the end to furnish the desire products.

Donato Germinario (Prof. M.Elisa Crestoni, Dott. Cascione Christian)
Durante questo anno di dottorato la mia attività ha riguardato la realizzazione dell'intero processo produttivo, a partire dalla produzione del Fluoro-18, passando alla sintesi della molecola Fluoro-colina, fino all'esecuzione di test chimici e radiochimici.
Sul prodotto finito sono stati eseguiti tutti test chimici e radiochimici eseguiti comunemente su un rilascio di prodotto radio-farmaceutico.
Successivamente sono stati eseguiti run di Validazione per valutare la stabilità del prodotto, al fine di garantire la stabilità di quest’ultimo per tutto l’arco temporale di utilizzo, considerando che il prodotto radio farmaceutico ha una validità di 8 ore dalla produzione.
Per concludere l’iter di convalida del prodotto, sono stati eseguiti le validazioni microbiologiche, validando il bioburden e la sterilità del prodotto.
Validazione del bioburden: La determinazione della carica microbica è un processo per la quantificazione e rilevazione della contaminazione microbica di un prodotto in diversi momenti della sua produzione, ovvero dalle fasi iniziali del processo fino alla dispensazione finale.
Validazione del test sterilità: Tale test è richiesto dalla GMP, è serve per confermare l’assenza di microrganismi vitali all’interno del prodotto finale. In campo radio-farmaceutico il test è eseguito dopo l’utilizzo del radio-farmaco. Quindi è un test di vitale importanza per concludere l’iter di rilascio del prodotto e garantire l’assenza di eventuali contaminazioni.
Bibliografia
1. ICH Q2(R1) November 2005: “Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology”
2. European Pharmacopoeia c.e., monograph Fluorocholine ( 18 F) injection monograph (2793)
3. EudraLex - Volume 4 Good manufacturing practice (GMP) Guidelines current edition
4. VR-CHI Valutazione del rischio chimico
5. Documenti e procedure aziendali

Maria Aurora Guarducci (Tutor: Prof. Claudio Villani)
L’attività di ricerca svolta durante quest’ ultimo anno di dottorato ha riguardato lo sviluppo di un modello catanionico per la sintesi di Metal Organic Frameworks (MOFs). Il razionale di questo progetto nasce da un precedente studio che prevede l’impiego di un sistema catanionico per la sintesi del COF-300.1 Numerosi sono i vantaggi ottenuti da questa strategia, in primis l’utilizzo di solventi acquosi, che grazie alla presenza di surfactanti anionici e cationici, permettono di creare un ambiente confinato per la crescita dei MOFs, assicurando la solubilizzazione dei precursori del sistema e minimizzando l’impiego di solventi organici, orientando l’intero processo verso una chimica più sostenibile; processabilità della sintesi a temperatura ambiente e pressione atmosferica; controllo della crescita dimensionale del MOF, altrimenti impossibile con i tradizionali approcci solvotermici. Sono stati sintetizzati i già noti in letteratura: Cu-CAT1, Mn@BTC, MIL-100 (Fe), MIL-53 (Fe), di questi ultimi due inoltre sono stati ottenuti i relativi sistemi dopati con magnesio. In seguito alla sintesi è avvenuta la caratterizzazione dei sistemi e ciò che è risultato evidente è che variando l’approccio sintetico si ottiene un sistema con una differente morfologia; infatti, molti di questi presentano una struttura fibrosa di diversi micron attraverso la sintesi tradizionale, mentre utilizzando l’approccio micellare si ottengono nanoparticelle di pochi nanometri; ciò rappresenta un vantaggio soprattutto da un punto di vista applicativo. Per quanto riguarda il Cu-CAT1 ed il Mn@BTC sono stati condotti studi per la valutazione di proprietà elettrochimiche, qualora questi si mostreranno promettenti l’idea è di combinarli al fine di ottenere supercapacitatori ibridi. Nel caso del MIL-100 (Fe), MIL-53 (Fe) e dei rispettivi sistemi dopati con magnesio è stato effettuato uno screening al fine di valutare come la presenza del magnesio, metallo biocompatibile, potesse influenzare le proprietà di biocompatibilità al fine di impiegare questi nell’ambito del trasporto dei farmaci.
Bibliografia
Gemma Llauradó-Capdevila, Andrea Veciana, Maria Aurora Guarducci. Tailored Design of a Water-Based Nanoreactor Technology for Producing Processable Sub-40 Nm 3D COF Nanoparticles at Atmospheric Conditions. Advanced Materials 2023, 2306345.

Lara Lamelza (Tutor: Dott.ssa Francesca Ghirga)
Negli ultimi anni numerosi sforzi sono stati compiuti per sviluppare immunosensori con prestazioni ottimizzate in termini di selettività, sensibilità, rapidità nella risposta e miniaturizzazione.1 Tuttavia, una delle principali sfide nello sviluppo di immunosensori è superare la complessità del legame degli anticorpi (Abs) sulla superficie del trasduttore. In questo contesto, la chimica supramolecolare è recentemente emersa come una possibile strategia di modifica superficiale per ottenere superfici preorganizzate e ordinate, in cui i biorecettori siano guidati ad assumere una disposizione orientata. Tra l'ampio pool di macrocicli disponibili, i resorc[4]areni sono caratterizzati da una struttura tridimensionale unica caratterizzata da una cavità centrale rigida e ricca di elettroni π che li rende ottimi sistemi host; inoltre, tale struttura può essere funzionalizzata sia nell’upper rim che nel lower rim con diversi gruppi funzionali per personalizzare le loro proprietà di riconoscimento.2 Sulla base degli studi precedentemente condotti che hanno dimostrato l’efficacia dell’utilizzo di resorc[4]areni come piattaforma versatile per l’immobilizzazione sito-specifica di Abs nello sviluppo di immunosensori,3,4,5 è stato progettato e sintetizzato un macrociclo a struttura resorc[4]arenica tetradiazo-funzionalizzato (R-N2+) solubile in acqua in grado di coniugare l’immobilizzazione sito-specifica degli anticorpi con la possibilità di sviluppare immunosensori elettrochimici con prestazioni ottimizzate. Nello specifico, il resorc[4]arene è caratterizzato dalla presenza di gruppi carbossilato nell’upper rim che favoriscono interazioni elettrostatiche con i residui amminoacidici carichi positivamente della porzione Fc dell’anticorpo e promuovono la solubilità in solventi acquosi, mentre il lower rim è stato funzionalizzato con anelli fenilici a cui sono stati introdotti sali di diazonio per favorire la funzionalizzazione di molteplici superfici mediante la tecnica dell’electrografting.
Bibliografia
(5) Bollella P. & Katz E., Biosensors - Recent advances and future challenges, Sensors, 2020, 20(22), 6645.
(6) Quaglio D., Polli F., Del Plato C., et al., Calixarene: a versatile scaffold for the development of highly sensitive biosensors, Supramolecular Chemistry, 2021, 33(7), 345-369.
(7) Quaglio D., Mangiardi L., Venditti G., et al., Site‐directed antibody immobilization by resorc[4]arene‐based immunosensors, Chemistry–A European Journal, 2020, 26(38), 8400-8406.
(8) Calcaterra A., Polli F., Lamelza L., et al., Resorc [4] arene-modified gold-decorated magnetic nanoparticles for immunosensor development, Bioconjugate Chemistry, 2023, 34(3), 529-537.
(9) Polli F., Cianfoni G., Elnahas R., et al., Resorc[4]arene Modifiers for Supramolecular Site‐Directed Immobilization of Antibodies on Multi‐Walled Carbon Nanotubes, ChemBioChem, 2023, 24(9), e202300030.

Marta Managò (Tutor: Prof. Federico Pepi)
L’attività di ricerca che ho condotto durante il terzo anno di dottorato si è incentrata sullo studio di reazioni ioniche in volumi confinati generati in unasorgente a ionizzazione elettrospray (ESI). Proseguendo lo studio di processi redox a carico di metalli nobili, abbiamo continuato a esaminare la possibilità di depositare nanoparticelle d’oro (AuNPs) su una superfice elettrodica di grafite (GSPEs) utilizzando una soluzione acquosa di acido cloroaurico, priva di agenti aggreganti e riducenti. Lo spettro di massa ESI di una soluzione acquosa di acido cloroaurico evidenzia la formazione di ioni contenenti specie ridotte dell'oro, evidenziando come le microgocce ESI rappresentino un mezzo in grado di catalizzare la riduzione di cationi metallici. In particolare abbiamo stimato che circa il 60% di acido cloroaurico viene ridotto ad oro metallico con formazione di aggregati di nanoparticelle d’oro di dimensioni tra 100 e 200 nm. Le nanoparticelle d’oro sono state poi funzionalizzate con il 6-ferrocenil-esantiolo, inviando sulla superficie elettrodica una soluzione di questo composto mediante la stessa sorgente ESI utilizzata per produrre le nanoparticelle d’oro. L’ottima attività catalitica mostrata dal 6-ferrocenil-esantiolo ha evidenziato la possibile applicazione di questa procedura nello sviluppo di nuovi biosensori elettrochimici.
Sempre sfruttando le capacità delle microgocce di catalizzare i processi all’interfaccia liquido-gas, è stata studiata la possibilità di formazione di liposomi in film sottili generati dalla deposizione di microgocce contenenti fosfatidilcolina. I risultati ottenuti tramite Dynamic Light Scattering (DLS) e Transmission Electron Microscopy (TEM) hanno confermato che i sistemi confinati generati dalla deposizione delle microgocce ESI possono produrre strutture vescicolari sferiche di dimensioni inferiori rispetto ai metodi tradizionali utilizzando inoltre concentrazioni di fosfatidilcolina nettamente più basse. Il vantaggio di ottenere vescicole più piccole con un minor consumo di reagenti può portare ad applicazioni significative nel campo della nanomedicina.

Beatrice Noce (Tutor: Prof. Antonello Mai)
La strategia della polifarmacologia, che prevede l'inibizione simultanea di due o più bersagli coinvolti nella patogenesi del cancro può migliorare l'efficacia terapeutica rispetto a un inibitore a bersaglio singolo. (1) Negli ultimi due decenni, gli inibitori delle istone deacetilasi (HDACi) si sono dimostrati strumenti efficaci nella ricerca e nella farmacologia oncologica. (2) Un altro bersaglio epigenetico di crescente importanza negli ultimi anni è l'unità catalitica del Complesso Repressivo Polycomb 2 (PRC2), la metiltransferasi EZH2 della lisina 27 dell'istone 3 (H3K27).(3) EZH2 è stato trovato sovraespresso o mutato in diversi tumori umani (4). La progettazione di tali ibridi è partita dallo scaffold del Tazemetostat, primo inibitore di EZH2 approvato dall’FDA,(4)(5) arricchito con gruppi molecolari noti per l’inibizione di HDACs. Tutti i nuovi ibridi HDAC/EZH2 sintetizzati sono stati sottoposti a screening in vitro tramite saggi enzimatici contro HDAC e contro un complesso PRC2 umano a cinque componenti contenente EZH2, da parte della Reaction Biology Corporation, per valutare la loro capacità di inibire l'attività catalitica di HDAC e EZH2 (IC50). Durante la mia esperienza nel laboratorio del Prof. Bertoni (Istituto di Ricerca Oncologica, Svizzera), ho valutato gli effetti cellulari degli inibitori più potenti per entrambi i bersagli. Questi potenziali inibitori sono stati studiati in diverse linee cellulari di linfoma, con o senza mutazioni di EZH2, per determinarne il potenziale anticancro. Tutti i composti testati hanno mostrato attività antiproliferativa nelle diverse linee di linfoma selezionate. Inoltre, tramite Immunoblotting, è stata confermata la capacità degli ibridi di ridurre i livelli del marcatore EZH2 H3K27me3 e di aumentare l'acetilazione globale dell'H3 correlata
all'inibizione di HDAC, confermandone il target engagement. Gli ibridi sintetizzati, inoltre, si sono mostrati in grado di sopprimere la crescita cellulare e modulare il ciclo cellulare. Infine, la modulazione dei geni legati a HDAC ed EZH2 è stata valutata attraverso il sequenziamento dell'RNA.
Bibliografia
(1) Fu RG, Sun Y, Sheng WB, Liao DF., Designing multi-targeted agents: An emerging anticancer drug discovery paradigm, Eur J Med Chem, 2017;136:195-211 .
(2) Stazi G, Fioravanti R, Mai A, Mattevi A, Valente S. Histone deacetylases as an epigenetic pillar for the development of hybrid inhibitors in cancer, Curr Opin Chem Biol, 2019; 50:89- 100.
(3) Richart L, Margueron R. Drugging histone methyltransferases in cancer, Curr Opin Chem Biol, 2020;56:51-62.
(4) Yang X., Xu L., Yang L., Recent advances in EZH2-based dual inhibitors in the treatment of cancers, Eur J Med Chem, 2023, 256, 115461.
(5) Straining R., Eighmy W., Tazemetostat: EZH2 Inhibitor, J Adv Pract Oncol, 2022, 13(2), 158- 163.

Filippo Umberto Sapienza (Tutor: Prof. Rino Ragno)
Studio che si è concentrato sull'analisi comparativa della composizione chimica di cinque oli essenziali, nello specifico Mentha piperita (menta piperita), Thymus vulgaris (timo), Lavandula stoechas (lavanda), Origanum vulgare (origano) e Eucalyptus cinerea (eucalipto). La composizione chimica è stata analizzata sia nella fase condensata che nella frazione volatile.
Analisi di soluzioni di OE in cicloesano
Analisi Headspace con pre-concentrazione selettiva tramite microestrazione in fase solida (SPME) Analisi Headspace (HS)
Analisi microbiologica degli oli esaminati, analizzati su ceppi MRSA, Candica Albicans, Acinetobacter Bauamnni. Comparazione risultati, diffusione, fase vapore.
Ho preso parte a un progetto denominato VOLA, che si occupa di raccogliere dati riguardanti la distillazione e l'estrazione di oli essenziali da piante aromatiche provenienti da tre diverse local ità: Tarquinia, Cerveteri e Rieti. Il progetto si concentra in particolare sulle piante di Cerveteri, per studiare le differenze nelle rese di olio, la quantità prodotta, e i composti chimici identificati tramite GC-MS. Inoltre, si analizzano i tempi di distillazione e l'influenza del periodo dell'anno sulla resa. Il mio ruolo include l'inserimento e la visualizzazione dei dati, attraverso grafici che ci permettono di tracciare
l'andamento dei vari parametri nel corso del periodo di studio, che va dal 2023 fino alla fine del 2024.

Federica Simonetti (Prof. Franco Mazzei)
L’attività di ricerca del terzo anno ha riguardato lo sviluppo di un sensore nanostrutturato per la determinazione untarget di composti perfluoroalchilici (PFAS) e tensioattivi anionici in matrici di acqua potabile. Il sensore è costituito da una piattaforma elettrochimica modificata con nanoparticelle d’oro e metilene blu, un colorante con proprietà ottiche ed elettrochimiche interessanti. La piattaforma è stata caratterizzata con diverse tecniche di spettroscopia ottica ed elettronica e testata su diversi campioni di acqua, valutandone effetto matrice, sensibilità, selettività e riproducibilità. Parte della ricerca si è poi svolta presso l’Istituto KWB di Berlino, in cui si è lavorato allo sviluppo di una rete bayesiana in python per la valutazione del rischio chimico da esposizione a PFAS, lungo il ciclo semi-chiuso urbano. A tal scopo è stata svolta una lunga raccolta di dati di letteratura e tramite librerie PyMC3 [1] e pgmpy [2] è stato sviluppato un codice, che consenta di ottenere un fattore di rischio RQ, stimato tramite distribuzioni di probabilità. Nel contempo, si è valutato come i composti perfluoroalchilici interagiscano con altri inquinanti, quali le microplastiche, aumentando il rischio di esposizione a tale classe di POPs (Persistent Organic Pollutants). A tal proposito, si è creato un modello di nanoplastica tramite software di chimica computazionale Gabedit [3] e l’adsorbimento del PFOS, uno dei più comuni composti perfluoroalchilici, è stato valutato a livello DFT, tramite software Orca 4.1.2 [4]. A supporto delle misure computazionali, si sono svolti esperimenti di adsorbimento in batch tramite HPLC/MSMS su nanoparticelle di polipropilene sintetizzate in laboratorio. Tali nanoparticelle sono state quindi analizzate morfologicamente e valutate come nuovo materiale adsorbente per self-sensing e nuovi remediation systems.
Bibliografia
[1] Salvatier, John, Thomas V. Wiecki, and Christopher Fonnesbeck. "Probabilistic programming in Python using PyMC3." PeerJ Computer Science 2 (2016): e55.
[2] Ankan, Ankur, and Abinash Panda. "pgmpy: Probabilistic Graphical Models using Python." SciPy. (2015).
[3] Allouche, Abdul‐Rahman. "Gabedit—A graphical user interface for computational chemistry softwares." Journal of computational chemistry 32.1 (2011): 174-182.
[4] Neese, Frank. "The ORCA program system." Wiley Interdisciplinary Reviews: Computational Molecular Science 2.1 (2012): 73-78.