• Le attività nell’anno 2021/22 del Corso di Dottorato in Scienze della Vita e sono, come nostra tradizione, state svolte secondo la seguente struttura:
Ciascun dottorando, oltre ovviamente a svolgere lavoro sperimentale finalizzato alla preparazione della propria tesi presso la struttura alla quale è assegnato, ha partecipato a (tutte le attività sono tenute in lingua inglese, con firma per stimolare la partecipazione), compresi corsi, seminari e journal clubs. L’eterogeneità e la complessità delle tematiche delle ricerche svolte nei laboratori dei docenti e dei tutors della scuola del dottorato costituiscono l’intrinseco valore aggiunto ma anche il fattore di criticità del corso. Particolare enfasi è quindi data, in tutte le attività svolte, al tentativo di mantenere e migliorare un sapere ed un lessico comune fra le varie discipline. Ogni dottorando è inoltre stato sollecitato a partecipare, a spese del dottorato, ad un convegno / workshops / corso (vedi attività dei singoli dottorandi). Ovviamente molte attività sono state svolte online e la mobilità relativamente ridotta, per le limitazioni oggettive.
Anche a tal fine, la scuola di dottorato ha organizzato per i nuovi studenti del 37 ciclo un Kick-off meeting, che ha visto la presenza degli studenti dei tre anni di corso, collegati telematicamente, svoltosi a gennaio 2022. La giornata è stata occasione di conoscenza e coinvolgimento, anche alla presenza del Coordinatore e di diversi membri del Collegio. Pur con le limitazioni dovute all'incontro in modalità telematica, la riunione ha riscosso un giudizio largamente positivo da parte degli studenti.
RELAZIONE ATTIVITA' SCIENTIFICA DEI DOTTORANDI 2021/22
ITALIANO
35mo ciclo (terzo anno)
Sara Andreone
L'obiettivo del progetto di dottorato è quello di esplorare i meccanismi antitumorali degli eosinofili, focalizzando l'attenzione sui checkpoint immunitari. Tali granulociti possono acquisire i checkpoint immunitari espressi dalle cellule tumorali attraverso la trogocitosi, processo fortemente incrementato dall'IL-33 che promuove il contatto CD11b/CD18 dipendente e l'incremento dell'espressone di ligandi specifici sugli eosinofili.
Marianna Bufano
Un protocollo di Virtual Screening è stato applicato su diversi target per l'identificazione di small molecules in grado di inibire la proliferazione di alcuni tipi di tumori. Studi di dinamica molecolare sono stati usati per studiare la stabilità dei binding mode proposti. Inoltre, utilizzando altri approcci di dinamica molecolare, come quella accelerata, è stato studiato il comportamento di alcune proteine scaffold dopo il legame con ligandi o proteine, permettendo di indagare sul loro possibile paesaggio conformazionale.
Elena Gugole
Caratterizzazione funzionale e strutturale di proteine coinvolte nella degradazione della lignina ad opera del fungo Picnoporus Cinnabarinus con particolare attenzione alla comprensione del meccanismo di azione della proteina ausiliaria PcODH.
Soyanni Holness
Le attività dell'ultimo anno hanno riguardato, ma non solo, lo studio dell'effetto di innesco di uno stress (HL) sulla risposta delle piante a uno stress successivo (siccità). Sono stati effettuati esperimenti di stress sequenziale e analizzato l'effetto di priming a livello molecolare e fisiologico mediante analisi dell'espressione genica qPCR e valutando l'efficienza della fotosintesi, lo stato dell'acqua e l'assimilazione del carbonio. Inoltre, è stato studiato H3K4me3 come un potenziale segno epigenetico che potrebbe essere associato a questa memoria di priming/stress.
Karimpour Ghavianeh Angela
Gli esperimenti hanno riguardato lo studio dell'associazione di GOLPH3 con mTOR. Tor è una proteina chinasi serina/treonina evolutivamente conservata, che controlla la crescita cellulare, la proliferazione, il metabolismo e la sopravvivenza come componente centrale di due complessi multiproteici denominati mTORC1 e mTORC2 (complessi mTOR 1 e 2). E' stato dimostrato che dGOLPH3 potrebbe regolare la formazione di complessi Rheb/Tctp reclutando Rheb nell'apparato di Golgi. Nel complesso, i miei dati forniscono la prima dimostrazione in vivo che GOLPH3 regola la crescita degli organi associandosi direttamente alle proteine di segnalazione mTOR.
Francesca Romana Liberati
Il progetto di dottorato è focalizzato sullo studio della riboregolazione di SHMT, enzima che ha un ruolo chiave nel metabolismo monocarbonioso (OCM) per il controllo dell'equilibrio redox delle cellule e la produzione di nucleotidi. Le isoforme di SHMT possono legare l'RNA; l'interazione RNA-SHMT1 (l'isoforma citosolica) non solo controlla la traduzione dell'RNA ma anche l'attività catalitica dell'enzima. A causa del ruolo delle proteine SHMT nell'OCM e dell'importanza di questa via per le cellule altamente proliferanti, la mancanza di inibitori efficaci che bloccano l'attività di questi enzimi rappresenta un enorme problema.
Durante il progetto di dottorato è stato dimostrato che avviene anche la riboregolazione dell'isoforma mitocondriale SHMT2 e che la caratteristica di SHMT2 di legame l'RNA potrebbe essere utilizzata per colpire questa proteina (in vitro, in cellulo, in vivo) attraverso la produzione di un inibitore basato sull'RNA (iRNA). Questa ricerca rappresenta un punto di partenza per comprendere come gli enzimi metabolici sono riboregolati e fornisce l’incipit per lo sviluppo di un approccio unico basato sull'RNA per inibire la crescita delle cellule tumorali, un nuovo strumento potenzialmente efficace in ambito chemioterapico.
Sara Petillo
L’inibitore della neddilazione MLN4924 induce l’upregolazione di MICA e MICB, ligandi del recettore attivatorio delle cellule Natural Killer (NK) NKG2D, sulla membrana delle cellule di Mieloma Multiplo promuovendo l’attività citotossica delle cellule Natural Killer che ha come risultato una maggiore lisi delle cellule di Mieloma. L’MLN4924, da solo e in misura maggiore in combinazione con gli anticorpi monoclonali Daratumumab e Elotuzumab, potenzia direttamente la degranulazione delle cellule NK e l’eliminazione delle cellule di Mieloma Multiplo come risultato della stabilizzazione delle proteine Rac1 e RhoA, Rho GTPasi coinvolte nel riarrangiamento del citoscheletro e nel rilascio di granuli citotossici in seguito al riconoscimento delle cellule target. Inoltre, l’inibizione della neddilazione in parte contrasta la compromissione delle funzioni effettrici delle cellule Natural Killer mediata dal TGFβ prevenendo l’attivazione del complesso CRL4-AMBRA1 che media la poli-ubiquitinazione non proteolitica di Smad4 e ne aumenta l’attività trascrizionale.
Caterina Sanchini
L’attività di ricerca di Dottorato si è basata sulla caratterizzazione del riarrangiamento del citoscheletro tubulinico indotto dalla attivazione microgliale, usando cellule primarie di microglia murina e validando i risultati ottenuti in vitro con un modello murino in vivo di attivazione microgliale in retina. I risultati hanno indicato che i microtubuli ricoprono un ruolo fondamentale per il rilascio di citochine e nei cambiamenti morfologici che si verificano durante il processo di attivazione microgliale. Lo studio ha inoltre suggerito che intervenire sui microtubuli può offrire strategie terapeutiche innovative per contrastare la neuroinfiammazione.
Setti Adriano
Il ruolo delle interazioni dell’RNA è stato approfondito in due ambiti riguardanti la patologia di muscolo e di motoneuroni: nell’ambito della patologia di muscolo, è stato studiato come l’espressione dei circRNA sia alterata nel tumore rabdomiosarcoma ed il ruolo dell’RNA elicasi DDX5 e del reader della modifica epitrascrittomica “m6A” YTHDC1 nel sostenere la loro espressione in questo tumore; nell’ambito della patologia di motoneuroni, è stato studiato come l’over-espressione della RNA binding protein FUS con sequenza WT o con mutazione associata alla Sclerosi Laterale Amiotrofica (P525L) influenza la composizione degli RNA negli “Stress Granules”, condensati molecolari citoplasmatici prodotti in risposta a stress ossidativo. In particolare, sono state caratterizzate le proprietà degli RNA che presentano un alterato reclutamento negli “Stress Granules” in presenza della proteina mutata ed il ruolo della modifica epitrascrittomica “m6A” in questo processo.
Beatrice Silvestri
Il Progetto di ricerca ha lo scopo di studiare i difetti delle giunzioni neuromuscolari e la morte cellulare nei casi di SLA sporadica e familiare dovuti alla mutazione FUSP525L, sfruttando le cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSCs) per ricapitolare un sistema modello di co-coltura nervo-muscolo.
Flavia Trionfetti
Durante quest’ultimo anno ci siamo focalizzati sulla valutazione degli effetti di HDAC1/2 (usando specifici inibitori epigenetici quali Entinostat, Mocetinostat e silenziamento genetico) in cellule mesoteliali (MCs) in due differenti modelli sperimentali sviluppati gli anni precedenti: 1) uso di Poly(I:C) per mimare una infezione da virus a dsRNA; 2) infezione di MCs con SARS-CoV-2.
Tucci Gloria.
Esperimenti in vitro ed in vivo per lo studio della capacità di soppressione di Treg TNFR2+ e TNRF2-.
36mo ciclo (secondo anno)
Maria Cristina Benedetti
Generazione di linee staminali pluripotenti indotte tramite l'uso del sistema CRISPR-Cas9 caratterizzate dalla presenza di mutazioni nel gene GNAO1. Differenziamento e caratterizzazione di una linea mutata e del suo controllo isogenico con l'obiettivo di osservare alterazioni durante lo sviluppo a livello molecolare e funzionale.
Giulio Bontempi
Inizio caratterizzazione del ruolo del lncRNA H19 nel processo di EMT in cellule primarie mesoteliali. Conclusione e pubblicazione dell' articolo“Restoration of WT1/miR-769-5p axis by HDAC1 inhibition promotes MMT reversal in mesenchymal-like mesothelial cells”. Collaborazione nell'articolo “Novel pyridine-containing histone deacetylase inhibitors strongly arrest proliferation, induce apoptosis and modulate miRNAs in cancer cells” valutando i marcatori di apoptosi e di proliferazione e valutando la modulazione di alcuni miRNA in seguito a trattamento farmacologico.
Luca D'Ambrosio
Le dinamiche mitocondriali sono modulatori della funzionalità delle cellule endoteliali, la loro compromissione può portare a disfunzione mitocondriale e al danno che ne consegue. Sono stati eseguiti analisi in vitro ed ex vivo per valutare le modulazioni dei livelli e della funzionalità della proteina OPA1 in cellule Huvec trattate con stressors cardiovascolari e la reattività vascolare in topi TgOPA1 e OPA1 +/-
Assia De Simone
L’espressione dei tetrapeptidi ripetuti PACL e QAGR nei motoneuroni riduce sia la vitalità che la locomozione dei moscerini. Inizialmente è stata analizzata la capacità di locomozione usando un driver muscolo-specifico Mef2, questo induce letalità pupale e difetti nella locomozione in entrambi i tetrapeptidi che possono essere calcolati misurando il numero di peristalsi. L’espressione dei peptidi nelle cellule tumorali della cervice uterina (HeLa) mostra una localizzazione di PACL all’interno del citoplasma mentre l’espressione di QAGR causa la formazione di aggregati di proteine all’interno del nucleolo. PACL potrebbe svolgere un ruolo nella formazione dei granuli di stress; quindi, delle cellule di controllo sono state trattate con arsenite che induce la formazione di granuli di stress e quando PACL viene fatto esprimere nelle cellule HeLa i granuli presenti in PACL colocalizzano con i granuli di stress in maniera molto simile a quelli presenti nelle cellule trattate con arsenite.
Chiara D'Antoni
Nel secondo anno di dottorato lo studio si è focalizzato sulla patologia X-Fragile utilizzando colture 2D e 3D. Tali colture sono state caratterizzate tramite real time PCR, immunofluorescenze e analisi di attività spontanea grazie al Calcium Imaging. Inoltre ho iniziato a testare l'effetto di KW-6002 su le colture bidimensionali e tridimensionali. Tale farmaco è attualmente approvato per il trattamento del Parkinson.
Davide Ialongo
In uno scenario clinico-farmaceutico sempre più dominato dalla diffusione dei nuovi farmaci biologici, le small molecules vivono un rinnovato interesse grazie alle loro caratteristiche chimico-fisiche e alla possibilità di venire appositamente progettate, rendendole uno straordinario punto di partenza per la progettazione di nuovi farmaci, specialmente in ambito antitumorale. Il progetto di ricerca, pertanto, alla luce dei dati del precedente anno, consiste nella progettazione e sintesi di inibitori innovativi di Eparanasi, a struttura ureidica o tioureidica simmetricamente funzionalizzata da eterocicli azotati, risultati attivi nel submicromolare nei confronti del target, in grado di inibire la proliferazione cellulare, la capacità di metastatizzazione e di indurre l’autofagia in diverse linee tumorali. Parallelamente, sono in fase di studio una serie di bis-anilinopirimidine e fenossipirimidine variamente funzionalizzate in grado di inibire diverse chinasi coinvolte nell’insorgenza del tumore (AURKA, VEGFR-A, PDGFR, EGFR, B-RAF, c-KIT, wt e mutate) in modo ortosterico mediante inibizione competitiva dell’ATP o in modo covalente grazie alla presenza di centri elettrofili o in grado di agire come inibitori dell’interazione proteina-proteina.
Chiara Longo
Per quanto riguarda il progetto principale, cioè lo studio del ruolo di PRC2 in risposta allo stress da freddo delle piante utilizzando anche una epidrug umana, RDS3434, sono stati eseguiti esperimenti di acclimatazione e freezing con una camera climatica Fitortron, e misurando i parametri fenotipici di stress di piante wild-type e mutanti prc2, con o senza trattamento farmacologico, è stato riscontrato che il trattamento con RDS3434 ha comportato una maggiore vitalità e un più alto contenuto di clorofilla delle piante acclimatate rispetto a quelle non trattate. Inoltre, a seguito una cinetica di espressione di geni chiave della risposta al freddo e dello stress abiotico, è stata progettata ed inviata un'analisi di sequenziamento dell'RNA. Per quanto riguarda il secondo progetto, in cui vengono saggiate epidrugs umane contro diversi bersagli epigenetici in pianta, come la famiglia HAC in Arabidopsis, omologa alla famiglia P300/CBP, dopo lo screening fenotipico, ho testato l'effetto delle molecole più efficaci, RDS3061 e RDS3029, sull'espressione genica, è stato clonato e purificato il dominio catalitico di HAC1 ed è stato eseguito eseguito un test di inibizione in vitro di RDS3061 e misurato il suo uptake da parte delle piante.
Walter Toscanelli
Studio dei pathway redox coinvolti nella regolazione della risposta infiammatoria alle infezioni da virus respiratori con particolare interesse nel ruolo della proteina APE1/REF-1 nella modulazione delle risposte cellulari immuni e antiossidanti all'infezione da influenza virus.
37mo ciclo (primo anno)
Usman Akhtar Butt IL progetto riguarda la caratterizzazione del microbiota in disordini del tratto urinario. E' stata effettuata una accurata ricerca in letteratura come introduzione della tesi. Sono state messe a punto tecniche di microbiologia, biologia molecolare e omiche. È stata avviata la raccolta dei campioni di urina dagli ospedali. Sono stati eseguiti esperimenti preliminari per individuare le migliori condizioni sperimentali da utilizzare nel progetto.
Erica Debbi
Analisi dell’impatto dei metalli pesanti del particolato atmosferico sullo sviluppo sinaptico mediante microscopia ad alta risoluzione. Differenziamenti neuronali corticali da iPSCs controllo e trattati con diverse dosi di Manganese. Saggi di vitalità MTS, RT-PCR, immunofluorescenze, esperimenti di calcium imaging. Chiarificazione di organoidi corticali (iDISCO Tissue Clearing).
Sara Di Russo
Il progetto di dottorato studia il microambiente tumorale, in particolare il processo di formazione di metastasi cerebrali di cellule di tumore al seno. È stato sviluppato un modello realizzato con cellule endoteliali di barriera ematoencefalica per poter analizzare la migrazione delle cellule di tumore al seno attraverso la barriera cerebrale e investigare il ruolo del glutammato e dell’ambiente infiammatorio nella formazione di metastasi al cervello da parte delle cellule tumorali.
Erica Floris
Il progetto si focalizza sulla caratterizzazione di cellule stromali cardiache primarie isolate da modelli murini di 5 settimane di età, knock-out per il long non-coding RNA Charme. Le cellule sono isolate mediante il metodo di coltura da espianto e viene caratterizzato il loro immunofenotipo, la loro abilità di crescita in 3D, la funzione paracrina esercitata su altri tipi di cellule cardiache, e la loro abilità di attivarsi e differenziare per mediare processi di riparazione cardiaca.
Paula Gragera Alvarez
Dopo la caratterizzazione di diverse linee cellulari, sono stati selezionati per lo studio un modello di melanoma e un modello di neuroblastoma. La tecnologia CRISPR/Cas9 è stata utilizzata come metodo per inibire stabilmente l'espressione di ERAAP nei modelli precedentemente citati. Il modello di neuroblastoma ERAAP-KO è stato ottenuto con successo e il protocollo è in fase di ottimizzazione per il modello di melanoma.
Greta Grassmann
Sviluppo di nuovi metodi computazionali per l’investigazione dei meccanismi molecolari alla base dell’interazione tra proteine, con l’obiettivo di creare un nuovo codice per il docking molecolare. Sono stati ideati due nuovi algoritmi, uno per ottenere la rappresentazione minima (in termini di numero di punti) di una superficie proteica e uno per stimare la complementarietà elettrostatica tra proteine interagenti. La capacita’ di entrambi di quantificare e predire l’interazione tra proteine quando uniti ad altri metodi -come la stima della complementarietà di forma basata sui polinomi di Zernike, che nel frattempo e’ stata applicata a sistemi di interesse come il complesso SARS-CoV-2 – ACE2-, sarà messa alla prova.
Alessio Incocciati
L'attività di ricerca del primo anno di dottorato si focalizzava sullo sviluppo, produzione e purificazione di ferritine ricombinanti per scopi teranostici. Nell'ultimo trimestre dell'anno si è proceduto alla caratterizzazione biochimica di queste varianti proteiche fino a testarne la loro efficacia su opportuni modelli sperimentali.
Kamila Julia Król
Indagine su 13 linee cellulari in materia di attività ERAP1 ed espressione proteica, espressione di superficie di classe I MHC. Progettazione di costrutti per knockout dell'esone 2 o 3 del gene ERAP1 con il sistema CRISPR-Cas9 e ottenimento di linee cellulari silenziate ERAP1 e dei loro equivalenti sgRNA codificati. Test di linee cellulari silenziate già stabilite: proliferazione e vitalità, efficienza di taglio, espressione proteica, espressione MHC di classe I, induzione di ERAP1 mediante stimolazione IFNg.
Antonia Intze
La morfologia e le modifiche di struttura secondaria delle proteine di α-sinucleina (αS) e TAR DNA binding protein 43 (TDP-43), durante il loro processo di aggregazione, sono state investigate tramite la tecnica di nanospettroscopia infrarossa chiamata AFM-IR (basata sull’accoppiamento di un microscopio a forza atomica con un laser IR). Tali modifiche strutturali sono state studiate monitorando i cambiamenti della banda di assorbimento Amide-I, che essendo correlata al modo vibrazionale del legame peptidico C=O, è sensibile alle diverse strutture secondarie proteiche (α-helix, parallel and antiparallel β-sheet, turn, and random coil). È stato inoltre studiato l’effetto della co-presenza di molecole di RNA sull'aggregazione in vitro della proteina αS, individuando, rispetto ai campioni senza RNA, differenze statisticamente significative nelle cinetiche di aggregazione, nella morfologia e nella percentuale di parallel β-sheet degli aggregati.
37 Francesca Romana Pellegrini In questo progetto andrò ad investigare il ruolo dell’acetilazione della tubulina, ed in particolare dell’acetiltransferasi ATAT1, nel processo autofagico e di come un suo coinvolgimento possa influenzare la progressione e l’aggressività del tumore al polmone. A tale scopo andrò a studiare, in colture di tumore al polmone, l'effetto dell'assenza o dell'iper-espressione dell'enzima ATAT1 sul processo autofagico e su altri hallmarks del cancro.
Michela Mochi
E' stata messa a punto una strategia di gene editing per ottenere una nuova linea di iPSCs contenente la mutazione P525L del gene FUS, con l'obbiettivo poi di utilizzare tale linea per ottenere organoidi neuromuscolari. E' stato messo a punto un plasmide che permettesse di overesprimere una particolare isoforma di una proteina (HuD) per approfondire le implicazioni nelle alterazioni molecolari e fenotipiche osservate nei motoneuroni con la mutazione del gene FUS. Utilizzando le linee generate, si sta mettendo a punto il protocollo per generare organoidi neuromuscolari esprimenti la mutazione P525L del gene FUS e wild type, precedentemente utilizzato nel laboratorio. Sono stati analizzati gli effetti dell'overespressione dell'isoforma di HuD a vari time point del differenziamento delle iPSC in motoneuroni e l'espressione della stessa isoforma sempre durante il differenziamento in linee wild type e omozigoti per la mutazione P525L di FUS.
Francesca Romana Pellegrini
E' stato esaminato il ruolo dell'enzima ATAT1 nel processo autofagico, in linee cellulari di tumore al polmone. Sono stati effettuati western blot per verificare l'effetto del silencing di ATAT1 su diversi marcatori autofagici come i cargo NBR1 e p62 o la proteina degli autofagosomi LC3. A seguito della generazione di una linea stabile esprimente la GFP fusa alla proteina LC3, sono stati effettuati degli esperimenti di microscopia per valutare l'aumento nella produzione di autofagosomi in cellule silenziate per ATAT1. Sono stati effettuati saggi con anche coloranti vitali che marcano mitocondri, lisosomi e lipidi ed esperimenti di depolimerizzazione e ripolimerizzazione dei microtubuli in diverse condizioni, in presenza ed assenza dell'enzima ATAT1.
Valeria Pennacchietti
Durante il primo anno di dottorato è stato caratterizzato il meccanismo di ripiegamento del dominio PTB della proteina FRS2 e l'interazione tra il dominio PTB e due ligandi, FGFR1 e TRKB. In particolare, esperimenti in cinetica suggeriscono che il dominio PTB si ripiega attraverso un meccanismo a tre stati con la formazione di un intermedio a bassa energia. Mentre, lo studio dell'interazione tra il dominio PTB e i due ligandi ha permesso di determinare alcuni dei residui coinvolti nel legame.
Alessandra Pinzon Grimaldos
Il progetto si propone di verificare che l'ipolipidemia indotta dall'assenza di ANGPTL3 influenza il metabolismo lipidico di monociti e macrofagi, induce ER stress, il quale supporta il pathway dell'interferone.
Serena Rosignoli
Le attività di ricerca per il 2022 si sono concentrate sullo sviluppo di più piattaforme dotate di GUI per assistere, le analisi di docking molecolare, le analisi di sequenza e struttura delle proteine e le analisi di interazione proteina-DNA. Tali piattaforme spaziano dall'essere plug-in del popolare Molecular Graphics Viewer PyMOL, all'essere sviluppate per un utilizzo da riga di comando, all'essere state integrate come web-server. Inoltre, i software sviluppati sono stati presentati anche a seminari e congressi, ed hanno iniziato ad essere utilizzati nei corsi didattici.
Filipa Vasconcelos
L'obiettivo principale della ricerca è lo sviluppo di sistemi di rilascio di modulatori ERAP/IRAP per proof of concept in vitro/in vivo con rilascio esteso in grado di bersagliare i tessuti e minimizzare gli effetti collaterali per il trattamento del cancro/malattie autoimmuni utilizzando tecniche di elettrospinning e nanoparticelle .
L'incapsulamento dei modulatori ERAP/IRAP in nanofibre e/o nanoparticelle e la relativa caratterizzazione è stata eseguita e ha raggiunto un tasso di rilascio prolungato quando testato per il rilascio di farmaci + quantificazione del farmaco;