Sirtuin 4 (Sirt4) è un’ epiproteina ad attività lisina-deacilasica NAD+-dipendente situata nei mitocondri e coinvolta nella regolazione di vari pathways tra cui il metabolismo degli acidi grassi, il rilascio di insulina, lo switch glicolisi-TCA e l’apoptosi cellulare modulando diversi enzimi, come la glutammato deidrogenasi (GDH) e la piruvato deidrogenasi (PDH). Sirt4, per via del suo coinvolgimento in questi pathways, risulta un potenziale target di farmaci per il trattamento del cancro e delle malattie metaboliche, anche se finora non sono stati segnalati inibitori potenti e selettivi. Quindi, abbiamo deciso di ricercare e sviluppare small molecules come inibitori Sirt4-specifici. I migliori candidati dopo uno virtual screening di una libreria di più di 1.3 milioni di composti sono il composto 2 ed il composto 15, con i valori IC50 di 46 e 67 pm, rispettivamente. Partendo da questi due composti abbiamo sviluppato una serie di derivati, e tra questi i composti 60 e 69 hanno mostrato valori di IC50 rispettivamente di 0,19 e 16 pM. Gli studi cinetici suggeriscono che i composti competono con il substrato dell’acil-peptide ma non con il NAD+, coerentemente con i modelli di docking. Studi di selettività mostrano inoltre la preferenza per Sirt4 rispetto ad altre isoforme; infatti, il composto 60 presenta una lieve attività verso Sirt2 e Sirt3, mentre il composto 69 è un inibitore selettivo di Sirt4. È interessante notare che i composti 60 e 69 aumentano in maniera dose-dipendente l’attività di GDH e PDH, due enzimi inibiti da Sirt4, nelle cellule C2C12 senza influenzare la vitalità cellulare. Inoltre, 69 inibisce la differenziazione degli adipociti, pathaway noto per essere modulato da Sirt4. In sintesi, il nostro studio ha identificato i primi inibitori Sirt4 potenti e selettivi, composti importanti come chemical tools utili per studiare la biologia di Sirt4 e il suo potenziale terapeutico in varie condizioni patologiche, comprese le malattie metaboliche e il cancro.
I siRNAs controllano la crescita, differenziamento e apoptosi cellulare poiché agiscono da silenziatori genici e proprio per questo, sono coinvolti in patologie come il cancro. L’acido peptidonucleico (PNA) è un polimero sintetico analogo al siRNA, RNA a doppio filamento ad azione oncopressoria, in grado di reprimere l’espressione di geni coinvolti nel cancro. Inoltre, ha un’elevata specificità per DNA e RNA ai quali si lega e forma un complesso altamente stabile . La ferritina HumAfFt (ottenuta dal batterio Archaeoglobus fulgidus), è una proteina umanizzata e la sua cavità interna può essere utilizzata per immagazzinare carici molecolari. Il progetto ha riguardato l’introduzione di linkers poliamminici (PAs), carichi positivamente, nella cavità interna della HumAfFt per favorire l’incapsulamento di PNA. Sono dunque state progettate e sintetizzate molecole a struttura piperazinica legate ad anelli piperidinici. Per legare le PAs ad un residuo di cisteina per monomero di ferritina sono state introdotte porzioni pentafluorobenzensolfonammidiche selettive verso gruppi tiolici. In particolare, è stato scelta la PA3.2 caratterizzata da un anello piperazinico e due nuclei piperidinici. La strategia sintetica per l’ottenimento dei linkers poliamminici è stata realizzata partendo dalla sintesi del composto poliamminico 2-(4-(1 '-metil-[1,4'-bipiperidin]-4-il)piperazin-1 il)etanammina che, infine, è stato coniugato al linker pentafluorobenzensolfonammidico.
La colistina è un antibiotico di tipo polimixinico che ha come bersaglio la membrana esterna dei batteri Gram-negativi con la quale effettua
un’interazione di tipo elettrostatico; tuttavia, il trasferimento enzimatico dello zucchero cationico Ara4N al lipide A, catalizzato daH’enzima glicosiltransferasi ArnT, permette ai batteri di acquisire resistenza alla colistina.
Studi precedenti hanno permesso l'identificazione del composto “ent-beyer-15-en-18-ossalato” FDO, un diterpene isolato dalle parti aeree della pianta Fabiana Densa var. Ramulosa, come il composto più promettente (hit compound) ed hanno permesso di validare lo scaffold ent-beyer diterpenico come una versatile piattaforma per la generazione di nuovi potenziali inibitori di ArnT.
Con lo scopo di rifinire le relazioni struttura-attività, è stata effettuata un’operazione di semplificazione e modifica chimica della struttura base ent-beyer diterpenica. In particolare, tre diterpeni (gli acidi abietico, deidroabietico e podocarpico) sono stati selezionati per lo studio dello scaffold abietanico. Tutti questi composti presentano i vantaggi di essere commercialmente disponibili e di essere caratterizzati da sistemi coniugati che ne permettono
l’analisi mediante HPLC.
Gli acidi sono stati utilizzati come materiale di partenza per la sintesi dei rispettivi derivati ossalici, identificati come migliori leganti di ArnT in studi di docking molecolare. La procedura sintetica è stata effettuata in due step: la riduzione della funzione acida mediante LÌAIH4, seguita dall’esterificazione dei corrispettivi alcoli con cloruro di ossalile.
In parallelo, in collaborazione con l’Università di Patrasso sono stati progettati e sintetizzati una serie di derivati a struttura abietanica in cui sono state introdotte una serie di modifiche a livello dello scaffold, in particolare nelle posizioni 12 e 13 della porzione aromatica. La funzione acida è stata precedentemente convertita in estere metilico, sono state effettuate quindi le reazioni sull’anello aromatico e la conversione dell’estere metilico in alcol primario, ed infine le funzionalizzazioni dell’alcol. Attualmente tutti questi composti sono in fase di valutazione biologica.
La malaria è ancora un’emergenza sanitaria globale, l’obiettivo dell’organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) è quello di ridurre l’incidenza della malaria del 90% entro il 2030.
Delle cinque specie di plasmodio capaci di causare la malaria nell’uomo, il Plasmodium falciparum è quella responsabile delle manifestazioni cliniche più letali che si presentano quando, in seguito alla puntura di zanzara Anopheles, gli sporozoiti raggiungono il circolo ematico.
Il ciclo replicativo del plasmodio è molto complesso: si compone di una fase sessuata, responsabile della trasmissione e di una asessuata, responsabile della sintomatologia. Il vaccino RTS,S/AS01 del 2021 e l’attuale terapia basata su farmaci che agiscono prevalentemente sulle fasi asessuate eritrocitarie del ciclo vitale non sono sufficienti ad eradicare la malattia. Da un recente screening su composti della Pandemie Response Box (PRB) della Medicine for Malaria Venture (MMV) è emerso che un derivato di BM212, un antitubercolare attivo come inibitore della proteina MmpL3, esplica la propria attività come transmission-blocking della malaria e non è attivo nella fase eritrocitaria. Si tratta quindi di composti capaci di prevenire la trasmissione uomo-zanzara e di bloccare il ciclo vitale del plasmodio. L’obiettivo del mio primo anno è stato quello di sintetizzare nuovi composti modificando lo scaffold pirrolico di BM212 per introduzione di nuovi sostituenti in N1, C3 e C5 per valutarne l’influenza sulla citotossicità, la lipofilia e
l’attività. Tutti i derivati sono stati sintetizzati secondo lo stesso schema di reazione che prevede una reazione di Stetter tra un’aldeide e il metil vinil chetone generando un intermedio successivamente sottoposto ad una reazione di Paal-Knorr per ottenere il core pirrolico, substrato della successiva reazione di Mannich. I derivati saranno valutati biologicamente dal gruppo di ricerca della professoressa Lyn Marie Birkholtz, della University of Pretoria, South Africa. Sulla base dei risultati ottenuti, saranno valutate le SAR per ottimizzare lo scaffold.
Alessandro Semeraro (Tutor: Prof. Giancarlo Fabrizi)
Durante il mio periodo di dottorato, ho acquisito competenze nell'uso di MatLab e altri linguaggi di programmazione, come Python e le sue librerie. Queste competenze saranno utili per l'analisi di dati provenienti da diverse strumentazioni utilizzate nel settore agro-alimentare. Il mio obiettivo principale era migliorare l'efficienza dell'analisi dati, riducendo il rumore e identificando dati incongruenti. Nel corso del mio studio su MatLab, ho esplorato le funzionalità per condurre analisi univariate e multivariate al fine di sviluppare un algoritmo di analisi personalizzato. Ho anche dedicato tempo alla ricerca e all'esame di vari database, concentrandomi sulla struttura e la categorizzazione dei dati relativi ai prodotti agricoli e alle loro caratteristiche molecolari, e seguito le riunioni del mio settore, con seminari e meeting riepilogativi. Inoltre, ho intrapreso una linea di ricerca volta
all'applicazione di tecniche computazionali di docking e simulazioni dinamiche per investigare l'associazione tra determinate proteine e lo sviluppo tumorale. Questo studio ha coinvolto l'analisi dei target proteici coinvolti e la valutazione comparativa di diversi programmi di docking al fine di selezionare il metodo più efficace. Ho imparato ad utilizzare l’algoritmo di l-Tasser, e Alphafold, su Colaboratory per la predizione di strutture proteiche utilizzando tecniche di deep-learning.
Relazione attività di ricerca dottorandi iscritti al 37° ciclo:
Giorgio Buttitta (Tutor: Prof.ssa Daniela Secci)
I liposomi sono le prime nanoparticelle a essere state sviluppate e tra le più studiate per la somministrazione di farmaci. Sono emersi in tutto il settore farmaceutico come sistemi particolarmente efficaci per la veicolazione di diverse molecole attive, andando a migliorare la farmacocinetica e la biodisponibilità e limitando al contempo la tossicità. Dal 1995, anno dell’approvazione da parte della FDA di Doxil®, come primo farmaco basato sulla tecnologia liposomiale, altri 14 prodotti farmaceutici sono stati approvati da EMA e FDA (senza contare i generici, i complessi lipidici e i prodotti liposomiali autorizzati a livello nazionale in Europa), che sono quindi attualmente disponibili in commercio. Nonostante i grandi progressi nella comprensione della produzione dei sistemi liposomiali, l’ottimizzazione delle proprietà chimico-fisiche dei liposomi in fase di sviluppo rimane un compito impegnativo e dispendioso temporalmente e economicamente parlando. Inoltre, la situazione diventa ancora più complessa quando si tenta di approcciarsi allo "scale-up". Per il presente studio si è deciso di riprodurre due sistemi liposomiali vuoti basati sulla composizione di prodotti attualmente in commercio Doxil© e Marqibo©. Ciò è stato fatto utilizzando un sistema "home made" di microfluidica in combinazione con un approccio di "Design of Experimet" (DoE). Tale combinazione si è dimostrata una strategia particolarmente efficiente per selezionare e ottimizzare rapidamente varie formulazioni di liposomi, ottenendo fino a 30 formulazioni diverse in 1 giorno. Basandosi sui risultati e i modelli matematici così ottenuti si è quindi proceduto a sfidare una versione "scale-up" del precedente sistema microfluidico. Mediante l'uso di quest'ultimo è stata dimostrata la possibilità di trasferire i parametri di processo precedentemente ottimizzati allo stesso e di conseguenza l'ottenimento di una strategia di produzione in grado di spaziare dalla scala del laboratorio a quella di una industria farmaceutica.
Vito Cosimo Carriero (Tutor: Prof.ssa Maria Antonietta Casadei)
L’attività di ricerca del secondo anno si è focalizzata sull’ottimizzazione e caratterizzazione di scaffold in grado di sortire effetti osteo-induttivi ed osteo- conduttivi. Per tale scopo sono stati preparati cryogel a base di gelatina e condroitina, polimeri che come riportato in letteratura hanno dimostrato avere effetti positivi sulla crescita e la differenziazione osteoblastica. E’ stata poi addizionata idrossiapatite in forma cristallina, materiale che possiede proprietà osteo-induttive sia sotto l’aspetto biologico che meccanico. Per garantire la formazione di gel chimici stabili, sono stati impiegati i derivati metacrilici di gelatina (GelMA) e condroitina (CSMA), secondo procedure sintetiche precedentemente ottimizzate o riportate in letteratura.
Lo studio si è articolato sulla caratterizzazione di cryogel omo-polimerici basati su GelMA o CSMA (G-HA e C-HA) ed etero-polimerici basati su miscele di GelMA e CSMA(GC-HA). I rispettivi cryogel privi di HA sono stati preparati e impiegati quale termine di confronto.
Gli studi preliminari del grado di rigonfiamento hanno evidenziato che l’inclusione di HA comporta una riduzione nella capacità di assorbimento di tampone fosfato nel sistema omo-polimerico G-HA. La caratterizzazione mediante microscopia elettronica a scansione (SEM) ha evidenziato come
l’inclusione di HA porta alla formazione di zone di disomogeneità strutturale, particolarmente evidenti all'interno dei sistemi G-HA e C-HA. I successivi test di compressione hanno evidenziato come tale disomogeneità si rifletta sulla riduzione della resistenza meccanica dei network G-HA e C-HA rispetto alle analoghe strutture prive di HA.
La disomogeneità del sistema è stata ricondotta a fenomeni di sedimentazione dell’HA durante la procedura di preparazione del criogel evidenziata dai test eseguiti mediante spettrofotometria UV-Vis. Il proseguimento del progetto prevede ulteriori studi di ottimizzazione, in particolare la stabilizzazione della sospensione di HA nelle soluzioni polimeriche, al fine di ottenere sistemi omogenei aventi proprietà fisiche e meccaniche idonee per la rigenerazione del tessuto osseo.
Carola Castiello (Tutor: Prof. Dante Rotili)
PRMT5 è una metil-trasferasi argininica che utilizza come cofattore la SAM; BET, invece, appartiene a una famiglia di reader epigenetici contenenti Br- domain, che permette di riconoscere le lisine acetilate sulle code istoniche promuovendo la trascrizione genica. Da evidenze scientifiche è stata riscontrata una sovra espressione di PRMT5 nel linfoma mantellare (MCL), inoltre il reader epigenetico BRD4, un membro delle proteine della famiglia BET, è cruciale per l’espressione di driver oncogenici nel linfoma. Quindi l’inibizione contemporanea di entrambi questi target può portare ad effetti benefici nel trattamento del linfoma. A tal fine, abbiamo pensato che la combinazione di un BETi e di un PRMT5Ì potesse essere più efficace rispetto a un inibitore a singolo target, ed abbiamo progettato e sintetizzato i primi inibitori duali PRMT5/BET, attraverso l’unione tra il noto inibitore di PRMT5 GSK3326595 con i noti inibitori di BET JQ1 o OTX015 attualmente in fase clinica. Le Sirtuine, invece, appartengono alla classe III delle HDAC e lavorano con un meccanismo NAD+ dipendente. Le sirtuine sono coinvolte in un’ampia gamma di processi fisiologici e patologici, compresi
l’invecchiamento, le malattie cardiache, la risposta allo stress e i disordini metabolici. Viste le numerose evidenze scientifiche riguardo il ruolo cardioprotettivo delle sirtuine neH’ischemia/reperfusion injury (IRI) cardiaca, abbiamo iniziato una collaborazione con il gruppo di ricerca della prof Joanna Andreadou ad Atene. Abbiamo selezionato tre composti attivanti le SIRT precedentemente sintetizzati nel laboratorio di Roma (MC2606, MC2789 e MC3215), ciascuno selettivo su una specifica isoforma di sirtuina, al fine di indagare il loro potenziale cardioprotettivo nell’IRI. Abbiamo portato avanti sia esperimenti in vitro su cellule endoteliali (EHAy) e cardiomioblasti (H9C2) per misurare la loro citotossicità e la vitalità cellulare (IC50 e MTT test), sia esperimenti in vivo su topo per valutare il loro effetto cardioprotettivo. Ulteriori studi sono necessari per capire il loro meccanismo
d’azione.
Michele Coluccia (Tutor: Prof.ssa Daniela Secci)
Nello studio delle malattie neurodegenerative, come Parkinson e Alzheimer, emerge come un incremento nella concentrazione a livello cerebrale di neurotrasmettitori, prime fra tutti l’acetilcolina e la dopamina, possa risultare benefica nel controllo dei sintomi. L’inibizione degli enzimi deputati al catabolismo di queste molecole risulta quindi essere una strategia perseguibile nella progettazione di nuovi composti da utilizzare nella terapia di queste malattie. Con questo obiettivo, parte del mio progetto di ricerca si è concentrato sullo sviluppo, sintesi e caratterizzazione di inibitori dell’enzima monoamino ossidasi B a struttura benzofuranica ottenuti mediante diverse vie e metodi sintetici. Una serie di composti a struttura 6- idrossibenzofuranica sono stati ottenuti mediante una sintesi onepot condotta in presenza di K2CO3 e PEG-400 o etanolo. Una seconda serie di composti, privi della funzione ossidrilica in 6, è stata ottenuta mediante reattore a microonde, in presenza di acetone e K2PO4. Tutti i composti sono stati purificati e caratterizzati mediante spettroscopia NMR.
Dal 1° marzo al 2 giugno 2023 sono stato ospitato nei laboratori del gruppo di ricerca Drug Discovery UP, presso l’Università di Porto, Dipartimento di Chimica e Biochimica, Portogallo, sotto la supervisione della prof.ssa Fernanda Borges e del dott. Daniel Chavarria. In questi mesi ho collaborato ai progetti di ricerca condotti dal team che mi ha ospitato: sintesi di composti inibitori verso l’enzima NADPH ossidasi (NOX) e valutazione dell’attività biologica di composti verso MAO-A, MAO-B e acetilcolinesterasi mediante saggi di inibizione enzimatica.
Nell’ultima parte dell’anno accademico il mio lavoro si sta concentrando sullo sviluppo di un protocollo sperimentale per valutare l’attività biologica dei composti sintetizzati verso MAO-A/B, a partire dall’esperienza sviluppata nei mesi trascorsi all’estero.
Michele D’Ambrosio (Tutor: Prof. Romano Silvestri)
II cancro è una delle minacce più impegnative da affrontare. Oggi è una delle cause di morte più prevalenti tra la popolazione, con un numero stimato di quasi due milioni di casi nel 2023. Molte strategie terapeutiche sono state sviluppate per contrastare questa malattia, dagli anticorpi monoclonali, come il bevacizumab, agli inibitori delle tirosin-chinasi, come l'imatinib, entrambi utilizzati per il trattamento del glioblastoma multiforme. Il problema di questi tipi di trattamento è l'invasività e la migrazione delle cellule tumorali. Perciò c’è la necessità di trovare nuovi approcci.
Il nostro gruppo concentra le sue attività di ricerca sullo sviluppo di piccole molecole, con una potenziale attività farmacologica come nuovi agenti antitumorali. Questi agiscono attraverso diversi meccanismi di azione, a seconda dello scaffold che posseggono. Durante il mio secondo anno di dottorato, il mio lavoro si è concentrato sulla progettazione e sintesi di nuove molecole per vari bersagli biologici.
Un primo set è stato basato sulla serie ARDHEP (aroil-dieterociclico pirroli), con l’intento di inibire la polimerizzazione della tubulina. L'introduzione di un anello pirimidinico nella posizione 1 della struttura pirrolica induce ferroptosi, una morte cellulare programmata ferro-dipendente. Esplorare i sostituenti della struttura ARDHEP era l'obiettivo principale di questo progetto, per ottenere maggiori informazioni sulle SAR. Un secondo progetto ha riguardato la funzione benzensolfonamidica. Questa è stata introdotta in diverse strutture, con l'intento di inibire il pathway Wnt/p-catenina. In primo luogo, in uno scaffold eterociclilfenilico, questo gruppo è stato in grado di legare il dominio 0-catenina armadillo repeats, mostrando attività antitumorale contro linee cellulari di cancro del colon-retto. In alternativa, il gruppo sulfamidico è stato inserito all’interno di una struttura pirrolica. Curiosamente, non solo questi composti hanno presentato un'inibizione di 0-catenina, ma hanno anche fortemente inibito l'anidrasi carbonica umana, esibendo il potenziale di un composto a doppio bersaglio.
Donato Germinario (Prof. M.Elisa Crestoni, Dott. Cascione Christian)
Durante questo secondo anno di dottorato la mia attività ha riguardato l’implementazione e la validazione dei metodi analitici per l’esecuzione delle analisi chimiche eseguite per il controllo qualità chimico del radio-tracciante [18F]-fluorometilcolina (FCH).
La progettazione e la convalida dell'intero processo di produzione, compresi i metodi analitici del controllo qualità, sono un passaggio obbligatorio per implementare e dimostrare la robustezza nell'elaborazione di routine, infatti solo i dati provenienti da un metodo analitico validato possono essere considerati affidabili per valutare la qualità del prodotto finale.
La validazione dei metodi analitici CQ è essenziale per dimostrare che le attività CQ siano affidabili e consentano di rilevare tempestivamente non conformità o fuori specifica del prodotto prima della messa in commercio di un lotto del farmaco.
La validazione di un metodo analitico si basa sui principi di accuratezza, precisione, sensibilità e specificità.
Nell’ambito del progetto specifico sono stati eseguiti e validati:
□ Metodo analitico per Radio-HPLC per la verifica della purezza chimica e radiochimica di soluzioni iniettabile [18FJ-FMC.
□ Metodo analitico per gas-cromatografico per la determinazione del dimetilformammide in soluzioni iniettabili di [18FJ-FMC.
□ Metodo analitico per Metodo gas-cromatografico per la determinazione dei solventi residui in soluzioni iniettabili di [18F]-FMC.
□ Metodo analitico per Radio-TLC per la verifica della purezza radiochimica di soluzioni iniettabile [18F]-FMC.
Maria Aurora Guarducci (Tutor: Prof. Claudio Villani)
Durante il secondo anno di dottorato, il lavoro è stato suddiviso in due parti principali. Nella prima parte, l'attenzione è stata focalizzata sulla sintesi e caratterizzazione di un nuovo "Covalent Organic Framework" impiegato nella catalisi eterogenea. I COF rappresentano una classe emergente di materiali organici porosi cristallini, ottenuti tramite l'interconnessione di elementi leggeri mediante legami covalenti. Questi materiali possono essere bi- o tri-dimensionali e sono completamente pre-progettati. Per raggiungere questo obiettivo, è stato progettato e sintetizzato un COF in seguito a
un'approfondita ricerca bibliografica. Il COF sintetizzato è stato caratterizzato utilizzando tecniche come spettroscopia IR, analisi termogravimetrica, diffrazione a raggi X, SEM e BET. L'obiettivo principale è stato ottimizzare il protocollo sintetico al fine di ottenere la struttura ottimale con il minor impatto ambientale possibile. Successivamente, è stata condotta la coordinazione del polimero con il rame, con successiva caratterizzazione tramite ICP-MS. Infine, è stata esaminata l'applicabilità di questo catalizzatore nella reazione "Copper(l)-Catalyzed Azide Alkyne Cycloaddition" (CuAAC). Nella seconda parte del lavoro, la ricerca è stata condotta presso l'Università di Barcellona, concentrandosi su due progetti principali legati ai Metal Organic Frameworks (MOF), nello specifico Cu-CAT1 e MIL-100 Fe. I MOF rappresentano una classe di strutture organiche cristalline, ottenute attraverso la combinazione di ioni metallici e molecole di ligando organico, stabilendo legami di tipo coordinativo 3,4. Per il progetto Cu-CAT1,
l'obiettivo è stato la creazione di un nanosistema innovativo attraverso un approccio micellare. Di conseguenza, è stata ottimizzata la sintesi al fine di ottenere la struttura migliore, con un impatto ambientale ridotto. Per quanto riguarda il progetto MIL-100 Fe, è stato seguito un protocollo già noto in letteratura, basato anch'esso su un approccio micellare. L'obiettivo di questo progetto è controllare l'accrescimento del materiale al di sotto dei 100 nanometri, al fine di utilizzarlo come carrier per il trasporto di farmaci.
Lara Lamelza (Tutor: Dott.ssa Francesca Ghirga)
Negli ultimi anni, particolare attenzione è stata posta nello sviluppare nuove statergie per contrastare l’antibiotico-resistenza. Una di queste consiste nel limitare il rilascio di antibiotici attivi nell’ambiente: la luce visibile può essere utilizzata come strumento per modulare l’attività dei farmaci, facilitandone l’attivazione e disattivazione. Studi precedenti hanno dimostrato come l’introduzione di photoswitches in piccole molecole permetta di controllare l’attività di composti antimicrobici. Recentemente, Just Baringo et al. ha descritto la progettazione e sintesi di un photoswitches,
l’amminoacido tetra-orto-cloro-dietilene-azobenzene (CEBA), che può essere utilizzato per controllare l’attività antibatterica di analoghi della tirocidina A mediante l’utilizzo di luce visibile. In particolare, dopo isomerizzazione mediante luce rossa, la forma cis diventerebbe l'isomero principale e ristabilirebbe la struttura secondaria biologicamente attiva del prodotto naturale. Pertanto, tali composti diventano attivi dopo irradiazione con luce rossa, ma si disattivano rapidamente mediante esposizione ad altre lunghezze d'onda della luce visible. Tuttavia, a causa della natura elettrofila del legame C-CI, il CEBA deve essere introdotto alla termine del peptide in crescita al fine di evitare l'uso di basi fortemente nucleofile, come la piperidina, utilizzata durante la sintesi peptidica in fase solida (SPPS). Per questo motivo, i metossi-azobenzeni rappresentano un’alternativa molto più interessante per l’SPPS in quanto possono essere isomerizzati a 650 nm (luce rossa), come i cloro derivati, ma non sono sensibili alla SNAr. Tuttavia, la sintesi di tali azobenzeni è altamente limitata. I metodi riportati in letteratura presentano rese estremamente basse e limiti nella
funzionalizzazione.8,9 Per superare tali restrizioni, lo scopo della seguente attività di ricerca è stato lo sviluppo di una nuova strategia per la metossilazione degli azobenzeni che consenta una vasta gamma di funzionalizzazioni e buone rese. Tale obiettivo è stato raggiunto tramite una procedura che prevede due fasi: 1) sintesi di tetra-orto-bromo-azobenzeni mediante C-H attivazione 2) cross-coupling dei derivati bromurati con metanolo.
Marta Managò (Tutor: Prof. Federico Pepi)
L’attività di ricerca nel mio secondo anno di dottorato si è incentrata sullo studio di reazioni in volumi confinati generati in una sorgente a ionizzazione elettrospray (ESI). Un primo studio ha riguardato la reazione acido catalizzata (H2SO4) di esterificazione degli amminoacidi nel film sottile ottenuto dalla deposizione di microgocce cariche. L’analisi dei prodotti finali recuperati sulla superfice bersaglio ha evidenziato la formazione di esteri degli aminoacidi investigati con rese intorno al 40%. La reazione condotta in soluzione nelle stesse condizioni non porta alla formazione di prodotti. Sfruttando le proprietà delle microgocce cariche abbiamo poi investigato la possibilità di depositare nanoparticelle d’oro su superfici elettrodiche partendo da soluzioni contenenti unicamente acido cloroaurico. Due minuti di deposizione sono stati sufficienti per aumentare notevolmente il segnale elettrochimico dell’elettrodo. Analisi SEM hanno confermato la presenza di nanoparticelle d’oro di dimensioni inferiori ai 100 nm sulla superfice elettrodica. Successivamente, è stata provata la possibilità di legare sulle nanopariticelle d’oro un mediatore redox sempre sfruttando l’elevata reattività delle molecole neH’ambiente confinato delle microgocce. L’avvenuta funzionalizzazione delle nanoparticelle d’oro ha rappresentato il primo passo per la possibile applicazione di questo metodo allo sviluppo di nuovi biosensori. Infine, utilizzando come modello la reazione di sintesi del Warfarin, è stata studiata per la prima volta la stereoselettività di una reazione condotta in microgocce cariche. Lo studio ha dimostrato che, nonostante la notevole accelerazione della reazione in microgoccia rispetto alla soluzione, la stereoselettività rimane comparabile.
Beatrice Noce (Tutor: Prof. Antonello Mai)
Le NADPH ossidasi costituiscono l’unica famiglia di enzimi (nei mammiferi sono presenti 7 differenti isoforme, NOX1-5, DUOX 1-2) la cui sola funzione è quella di generare specie reattive dell’ossigeno (ROS). Le NOXs presentano una serie di elementi condivisi, tra cui un dominio transmembrana, costituito da sei eliche che coordinano due gruppi heme, e un dominio deidrogenasi, in cui sono presenti il sito di legame per il FAD e per il NADPH. Numerose sono le implicazioni patologiche delle stesse. Fra gli inibitori delle NOXs ad oggi conosciuti abbiamo una serie di molecole che agiscono direttamente sui ROS, mentre dall’altro lato ci sono inibitori che agiscono specificamente sulle NOXs ma, quelli finora noti, non sono sufficientemente selettivi per le varie isoforme. Tramite uno screening di una libreria di composti dei laboratori di Boston, è stato ottenuto M41, un promettente lead- compound. L’osservazione del co-cristallo dell’inibitore non competitivo legato all’enzima ha indirizzato lo scopo della nostra ricerca verso la semplificazione molecolare di M41, al fine di rendere più druggabile la molecola, ottenendo dei promettenti inibitori a struttura chinolinica, non solo potenti, ma anche selettivi per le varie isoforme. Spostandoci nell’ambito dell’epigenetica troviamo un progetto riguardante la sintesi di nuovi inibitori ibridi duali EZH2/HDACs, come approccio farmacologico per la cura di forme tumorali. La progettazione di tali ibridi è partita dallo scaffold del Tazemetostat, primo inibitore di EZH2 approvato dall’FDA (come Tazverik®) per il trattamento del sarcoma epitelioide metastatico o localmente avanzato, arricchito con gruppi molecolari noti per l’inibizione di HDACs. Sono stati sintetizzati 12 analoghi, successivamente testati in vitro contro le HDACs e contro EZH2, al fine di valutarne l’abilità di inibire l’attività catalitica (IC50) delle stesse. Gli inibitori più potenti su entrambi i target saranno studiati in diversi contesti tumorali, da differenti linfomi a tumori solidi, inclusi glioblastoma e rabdomiosarcoma.
Filippo Umberto Sapienza (Tutor: Prof. Rino Ragno)
L’attività di ricerca svolta durante l’anno di dottorato consiste nell’applicazione di tecniche di chimica computazionale e data science in vari progetti e su vari target, la caratterizzazione del profilo chimico degli oli essenziali tramite GC\MS. Il protocollo proposto ha come obiettivo lo studio approfondito del ruolo che i singoli componenti degli OE rivestono ai fini dell’attività biologica e microbiologica. Sono state condotte diverse analisi dei dati nei confronti di tutti gli OE distillati tramite l’utilizzo del software di programmazione python col fine di valutare l’abbondanza dei composti presenti, le loro % e tutte le diverse caratteristiche della pianta dal quale vengono estratti (periodo di raccolta, sito, clima, etc.). Valutazione del potenziale antiossidante di oli essenziali sono emersi con la collaborazione del dipartimento di chimica e, successivamente, insieme al gruppo di ricerca dell’università degli studi di Ferrara. Attuazione di un nuovo progetto di ricerca legato allo studio dell’attività del potenziale antiossidante legato agli essenziali tramite l’utilizzo di tecniche elettrochimiche per mezzo del hardware palmsens e relativo software di supporto e lettura PStrace. Scansione lineare e voltammetria ciclica applicata a campioni di oli essenziali e relativi idrolati, previa distillazione in corrente di vapore (tecnica in continuo e tecnica frazionata) e caratterizzazione del profilo chimico. Per la caratterizzazione del profilo chimico ho avuto modo di collaborare con la dott.ssa Caterina Fraschetti presso il dipartimento di Chimica e tecnologie del farmaco alle analisi GC\MS, prendendo attivamente parte al lavoro. Sono state effettuate le analisi su diversi oli essenziali ed idrolati con due diverse tecniche; microestrazione e spazio di testa e, i risultati sono stati successivamente comparati. Ho avuto modo di collaborare alla stesura di alcuni articoli scientifici, riguardanti oli essenziali, idrolati e ML. Nel periodo di tirocinio fuori sede è iniziata una collaborazione con un’azienda che ha come progetto la produzione di oli essenziali a partire da materiale destinato allo smaltimento.
Federica Simonetti (Prof. Franco Mazzei)
I cambiamenti climatici e le sempre più stringenti normative in materia ambientale necessitano lo sviluppo di nuovi strumenti di misura sensibili ed economici che permettano il monitoraggio in real-time di indicatori globali di qualità ambientale. Interesse primario di tale lavoro è lo sviluppo di nuove piattaforme elettrodiche per la valutazione di due indicatori ambientali: la domanda chimica di ossigeno (COD) e il potenziale ossidativo (OP). La COD viene definita come la quantità di ossigeno necessaria ad ossidare completamente le sostanze organiche presenti nell’acqua. I metodi standard prevedono l’utilizzo di reattivi tossici per l’ambiente e per l’uomo, nonché lunghi tempi di analisi e subiscono l’interferenza da parte dei cloruri. Per la rivelazione di questo parametro, nanoparticelle anisotropiche ramificate in lega oro ed ossido di rame (AuCuONBs) sono state sintetizzate ed impiegate per la modifica di elettrodi realizzati in stampa serigrafica a base di carbonio (SPCE). Le AuCuONBs catalizzano l’ossidazione del glucosio, utilizzato come standard, e di altri composti organici. Per la validazione del sensore sono state effettuate misure di riproducibilità, selettività, interferenza e primi test su campioni reali. L’OP è un indicatore globale della qualità dell’aria associato al particolato atmosferico. I classici metodi di rivelazione prevedono l’incubazione di dispersioni acquose di particolato atmosferico con sonde fluorescenti, che vengono ossidate dalle specie reattive dell’ossigeno (ROS) generate in situ dalle polveri. Pertanto, è stato sviluppato un biosensore in cui la proteina redox citocromo c viene impiegata come biorecettore in grado di catalizzare la riduzione dell’acqua ossigenata (H2O2), quale standard. Assieme al citocromo c vengono impiegate anche nanostelle d’oro (AuNSs): nanoparticelle anisotropiche che, oltre a promuovere una migliore conducibilità e il trasferimento elettronico (ET) alla superficie dell’elettrodo, presentano attività perossidasica, coadiuvando il biorecettore nella catalisi. Infine, il sistema è stato calibrato con concentrazioni crescenti di H2O2 e testato su campioni reali di polvere certificata NIST.