Titolo della tesi: Vaccine Production using Plants as Alternative Expression System
La pandemia di COVID-19 e la crescente frequenza di emergenze sanitarie globali hanno evidenziato la necessità di piattaforme di produzione vaccinale non solo rapide e flessibili, ma anche scalabili, sostenibili e accessibili a livello mondiale. I sistemi di espressione convenzionali basati su cellule di mammifero o su microrganismi batterici risultano limitati da elevati costi di produzione, infrastrutture complesse e scarsa scalabilità. Tali sistemi si dimostrano inaccessibili in particolare nei Paesi a basse risorse. In questo contesto, il Plant Molecular Farming (PMF) è emerso come un’interessante alternativa, sfruttando la capacità intrinseca delle piante di produrre biotecnologicamente molecole complesse. Il PMF consente tempi di produzione ridotti, bassi investimenti iniziali e la possibilità di sviluppare sistemi di biomanifattura decentralizzata, affrontando così alcune delle principali limitazioni dei sistemi vaccinali tradizionali.
Questa ricerca di dottorato ha esplorato il Plant Molecular Farming come piattaforma alternativa per la produzione di vaccini, con particolare attenzione alle fasi di downstream processing e purificazione, che rappresentano tuttora i principali ostacoli per la traslazione industriale. Sono state indagate due strategie vaccinali complementari – vaccini a proteina ricombinante e vaccini a base di acidi nucleici – al fine di condurre un’analisi comparativa in termini di fattibilità di processo e complessità analitica.Il progetto è stato strutturato in due fasi complementari, una condotta in un contesto industriale e l'altra in un ambiente accademico, consentendo di approfondire entrambe le prospettive.
La prima fase è stata svolta presso l'azienda farmaceutica Special Product's Line (SPL - Anagni, Italia) e ha riguardato lo sviluppo di un processo downstream per la sequenza TB002, una proteina ricombinante candidata come vaccino contro la tubercolosi TB e prodotta in Nicotiana benthamiana. L'ottimizzazione del processo ha incluso lo screening dei tamponi, la cromatografia di affinità con metalli immobilizzati, la rimozione dei tag mediata dall'enzima trombina e il polishing finale. Nonostante le difficoltà incontrate, in particolare l'aggregazione proteica e la perdita di prodotto durante la sterilizzazione, è stato stabilito un protocollo robusto che ha consentito l'espressione di un vaccino ricombinante a subunità adatto alla validazione preclinica.
La seconda fase è stata condotta presso l'University College London (UCL - Londra, Regno Unito) e si è concentrata sulle piattaforme vaccinali a base di acidi nucleici. Un modello di vaccino a mRNA che codifica GFP è stato adattato per l'espressione vegetale utilizzando il vettore binario pGreenII ed è stato espresso in Nicotiana benthamiana tramite infiltrazione mediata dal batterio Agrobacterium. L'espressione in pianta è stata confermata e diversi metodi di estrazione e purificazione sono stati confrontati, tra cui cromatografia a scambio anionico e cromatografia di affinità oligo(dT), cattura con microsfere magnetiche e kit commerciali a base di silice. Sebbene sia stato possibile purificare in parte la sequenza di interesse, la resa e la purezza si sono dimostrati fortemente dipendenti dal metodo utilizzato, evidenziando la complessità tecnica della purificazione dell'mRNA di origine vegetale. Parallelamente, sono state sviluppate particelle Virus-Like (VLP) derivate dal Cowpea Chlorotic Mottle Virus (CCMV) al fine di adattarle come nanocapsule protettive per l'mRNA di interesse. La proteina di rivestimento è stata espressa sia in E. coli che in N. benthamiana, purificata utilizzando una combinazione di strategie cromatografiche e testata per l'assemblaggio/disassemblaggio in condizioni di pH controllato. Questi studi hanno fornito i risultati a conferma della possibilità di produrre VLP a base vegetale e la loro potenziale applicazione nell'incapsulamento dell'mRNA.
Nel complesso, durante questo lavoro di Dottorato sono state dimostrate sia le opportunità che i limiti del Plant Molecular Farming applicato all'espressione di vaccini. Gli studi su scala industriale evidenziano la fattibilità di processi compatibili con protocolli GMP, mentre le ricerche accademiche hanno ampliato l'ambito di applicazione della PMF verso piattaforme di nuova generazione che integrano la produzione di mRNA e di nanocages VLP. Nel loro insieme, questi risultati confermano il potenziale delle piante come biofabbriche versatili, sostenibili e scalabili per lo sviluppo futuro di vaccini.