Titolo della tesi: VALIDATION OF INTRABODIES AGAINST THE E6 AND E7 ONCOPROTEINS: A TARGETED THERAPEUTIC APPROACH FOR THE TREATMENT OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS 16 - ASSOCIATED LESIONS
I papillomavirus umani (HPV) sono un gruppo eterogeneo di virus a DNA, alcuni dei quali classificati come ad alto rischio a causa della loro associazione causale con il cancro cervicale e altre neoplasie anogenitali e orofaringee. Tra questi, l’HPV16 rappresenta il genotipo ad alto rischio più diffuso ed è responsabile della maggior parte dei tumori cervicali associati all’HPV.
La vaccinazione profilattica si è dimostrata altamente efficace nel prevenire l’infezione da HPV ed è attualmente disponibile contro fino a sette genotipi ad alto rischio (HPV16, 18, 31, 33, 45, 52, 58) e i tipi a basso rischio 6 e 11. Tuttavia, questi vaccini non hanno alcun effetto terapeutico sulle infezioni già instaurate o sulle lesioni e tumori causati dall’HPV. Inoltre, la copertura vaccinale incompleta e la persistenza di genotipi oncogeni non inclusi nei vaccini attuali evidenziano l’urgenza di sviluppare strategie terapeutiche mirate.
Tra i determinanti virali degli HPV ad alto rischio, le oncoproteine E6 ed E7 sono espresse costitutivamente nelle cellule infette e promuovono la trasformazione maligna inattivando rispettivamente i soppressori tumorali p53 e pRb, compromettendo numerosi processi cellulari dell’ospite. Gli anticorpi ricombinanti in formato a catena singola espressi intracellularmente (intrabodies) rappresentano una strategia promettente per neutralizzare selettivamente le oncoproteine virali e ripristinare le funzioni soppressive tumorali.
Il presente lavoro analizza l’impatto molecolare e funzionale di due intrabodies sviluppati presso l’Istituto Superiore di Sanità contro le oncoproteine dell’HPV16, in cellule SiHa positive per HPV16. L’anticorpo anti-16E6 I7NUC e l’anticorpo anti-16E7 43M2SD si localizzano rispettivamente nel nucleo e nel reticolo endoplasmatico. L’analisi trascrittomica (RNA-seq) ha mostrato effetti distinti: I7NUC ha indotto una riprogrammazione estesa dell’espressione genica, con oltre dodicimila geni differenzialmente espressi, down-regolando pathway legati all’omeostasi proteica, al traffico nucleocitoplasmatico, all’elaborazione delle proteine del reticolo endoplasmatico, al rimodellamento della cromatina, alla senescenza, alla proteolisi mediata dall’ubiquitina, alla biogenesi dei ribosomi e al metabolismo. L’analisi di rete ha evidenziato che molti geni down-regolati codificano binder diretti di E6, suggerendo che I7NUC possa interrompere la rete oncogenica centrata su E6. Al contrario, 43M2SD ha modulato circa mille geni, arricchendo significativamente solo il pathway delle interazioni citochine-recettore, senza binder diretti di E7, indicando un effetto più limitato o indiretto sulla segnalazione cellulare.
Per superare i limiti delle colture bidimensionali, le analisi sono state estese a sferoidi tridimensionali (3D) di SiHa, che ricapitolano le principali caratteristiche dei tumori solidi, come gradienti di ossigeno e nutrienti e eterogeneità spaziale. In questo modello, I7NUC ha mostrato un picco di espressione rapido e marcato, associato all’inibizione della crescita degli sferoidi. Analisi RT-qPCR a diversi intervalli di tempo hanno confermato l’attivazione del pathway p53 e una risposta dinamica mediata da IFN-γ, con up-regolazione precoce di IFN-γ e dei geni effettori a valle, seguita da attenuazione tardiva. L’espressione prolungata di I7NUC ha portato alla down-regolazione dei geni legati allo stress del reticolo endoplasmatico e alla difesa ferroptotica, suggerendo un progressivo indebolimento dei pathway di sopravvivenza adattativa.
Al contrario, 43M2SD ha mostrato un accumulo più lento, maggiore variabilità e modesti effetti sul volume sferoidale, suggerendo bassa efficacia e necessità di ottimizzazione della somministrazione.
In sintesi, l’inibizione nucleare di E6 da parte di I7NUC innesca un programma antitumorale multiforme, coinvolgendo il ripristino della funzione di p53, la soppressione di pathway oncogenici, l’interferenza con i circuiti metabolici e proteici e la modulazione della segnalazione immunitaria intrinseca. L’attività di I7NUC negli sferoidi 3D supporta il suo potenziale come candidato terapeutico per le neoplasie associate all’HPV16, sottolineando l’utilità delle strategie basate su anticorpi intracellulari per il targeting degli oncogeni virali, e l’utilizzo dei modelli tridimensionali come piattaforme fisiologicamente rilevanti.