Dottorato in MEDICINA SPERIMENTALE

Titolo della tesi: Microbial co-infections and innate immune responses in human papillomavirus mucosal infections: insights from in vivo and in vitro models

Introduzione: Il papillomavirus umano (HPV) rappresenta l'infezione sessualmente trasmessa più diffusa a livello globale. Sebbene nella maggior parte dei casi l'infezione venga risolta dal sistema immunitario entro 18 mesi, i genotipi ad alto rischio (HR-HPV) possono persistere e condurre allo sviluppo di tumori invasivi, in particolare della regione anogenitale. Comorbilità come la vaginosi batterica (BV) e co-infezioni microbiche, sia comuni che emergenti, possono favorire la persistenza dell’HPV e la progressione neoplastica compromettendo l’integrità della mucosa e la risposta immunitaria. A seguito dell’infezione, HPV viene riconosciuto dai recettori di riconoscimento del patogeno (PRRs), in particolare dai recettori Toll-like (TLRs), che stimolano la produzione di interferoni di tipo I e III (IFN-I e IFN-III), avviando una cascata di geni stimolati dagli interferoni (ISGs) con funzioni antivirali, immunomodulatorie e antiproliferative. Tuttavia, l’impatto delle co-infezioni sulla risposta immunitaria innata ad HPV rimane poco chiaro, specialmente nelle fasi iniziali dell’infezione. Sebbene gli studi in vitro abbiano fornito diverse indicazioni, quelli in vivo sono stati ostacolati dalla mancanza di modelli animali adeguati. La scoperta del papillomavirus murino (MmuPV1), che riproduce fedelmente l’infezione mucosale da HPV nell’uomo, rappresenta un traguardo significativo. Studi condotti su modelli murini immunodeficienti hanno evidenziato il ruolo cruciale della risposta IFN nel controllo dell’infezione e nella progressione delle lesioni. Sulla base di queste considerazioni, il presente progetto di dottorato combina approcci microbiologici, virologici e viro-immunologici per studiare la prevalenza delle infezioni da HPV e gli effetti delle co-infezioni microbiche sulle vie di segnalazione dell’IFN a livello della mucosa umana. Inoltre, il progetto mira a sviluppare un modello di infezione da MmuPV1 nei cheratinociti murini e a identificare selettivamente gli ISGs coinvolti nella regolazione dell’espressione genica di MmuPV1. Materiali e Metodi: In questo studio sono state arruolate coorti di donne e uomini, sulla base di criteri di inclusione rigorosi, afferenti all’Unità di Patologia Cervico-Vaginale e alla Clinica Proctologica del Policlinico Umberto I, Sapienza Università di Roma. L’identificazione e la tipizzazione dell’HPV, nonché la diagnosi molecolare della vaginosi batterica (BV) nelle donne e delle infezioni sessualmente trasmesse (STI) (HIV, MCPyV, JCPyV, BKPyV) negli uomini, sono state effettuate su campioni cervicali e anali. I livelli di espressione dei geni codificanti per TLR9, IFN-III (IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-λ3), la subunità recettoriale specifica IFNLR1 e ISG15 sono stati misurati mediante saggi TaqMan/RT Real-Time PCR. Parallelamente, cheratinociti murini (MPEK-BL6) sono stati infettati con MmuPV1 in condizioni sia di proliferazione che di differenziamento. L’espressione genica virale è stata monitorata per 7 giorni mediante saggi digitalPCR (dPCR) mirati ai trascritti precoci (E1^E4) e tardivi (L1). L’espressione degli ISGs (ISG15, HERC6, PLSCR1, IFI35, IFI27, IRF7, SP100, OAS3) è stata misurata mediante RT Real-Time PCR a 1, 2, 5 e 7 giorni post-infezione. Risultati: Tra le 120 donne arruolate, il DNA di HPV è stato rilevato in 51 (42,5%) campioni cervicali. Il 42,9% delle donne HPV-positive di età compresa tra 18 e 27 anni presentava genotipi ad alto rischio, principalmente HPV16, HPV53 e HPV18. Oltre il 50% delle partecipanti presentava vaginosi batterica (BV) e almeno una STI, con un’elevata co-presenza di tali condizioni. In particolare, i batteri associati a BV, come Gardnerella vaginalis e Atopobium vaginae, erano più frequenti nelle donne HPV-positive rispetto alle donne HPV-negative. Per valutare la prevalenza di HPV a livello anale, sono stati raccolti tamponi anali da 691 partecipanti (n=191 donne; n=500 uomini). Gli uomini hanno mostrato una maggiore positività ad HPV rispetto alle donne (75,4% vs. 44,5%). Il tasso più elevato è stato osservato negli uomini HIV-positivi (83,5%), mentre gli uomini HIV-negativi erano più frequentemente HPV-positivi rispetto alle donne (68,3% vs. 43,6%). Circa il 51% dei casi è risultato positivo per i genotipi inclusi nel vaccino quadrivalente (HPV6, 11, 16, 18) e un ulteriore 16% per quelli inclusi nel vaccino nonavalente (HPV31, 33, 45, 52, 58). Nei soggetti che vivono con HIV (PLWH) e co-infetti da HPV, la triplice co-infezione con MCPyV (37,5%) era significativamente più frequente rispetto a BKPyV (3,1%) e JCPyV (0%), con cariche virali di MCPyV più elevate nei casi di co-infezione MCPyV/HPV/HIV. L’analisi immunologica ha rivelato pattern distinti tra la mucosa cervicale e quella anale. Livelli più elevati di TLR9 e IFN-λ1 sono stati osservati nelle donne con infezione da HPV a basso rischio rispetto a quelle con HPV ad alto rischio. La BV e le STI aumentavano ulteriormente l’espressione di IFN-λ2 e IFNLR1 nelle donne HPV-positive. Negli uomini, l’infezione anale da HPV era associata a livelli inferiori di TLR9, IFN-λ1 e IFN-λ3. La co-infezione con HIV e HPyV ha determinato una soppressione dell’espressione dei geni IFN. Tuttavia, analogamente a quanto osservato nella mucosa cervicale, l’espressione di IFN-λ2 è risultata aumentata negli uomini HPV-positivi con co-infezione da HPyV e HIV. Nel modello in vitro di infezione da MmuPV1, i trascritti virali precoci (E1^E4) hanno mostrato un’espressione moderata in condizioni proliferative, con un incremento nel tempo durante il differenziamento, in cui sono stati rilevati i trascritti tardivi (L1) in fasi più avanzate dell’infezione. L’analisi degli ISGs antivirali ha evidenziato una significativa riduzione dei loro livelli trascrizionali nel tempo che potrebbe contribuire alla persistenza dell’infezione insieme all’aumento dei trascritti virali. Conclusioni: Questo progetto di dottorato evidenzia il valore di un approccio multidisciplinare che combina studi epidemiologici, immunologici in vivo e in vitro per migliorare la comprensione della risposta mucosale dell’IFN all’infezione da HPV. Sensibilizzare la popolazione sui rischi legati alle infezioni cervicali e anali da HPV, nonché sui benefici della vaccinazione, rimane una priorità di salute pubblica. Le analisi molecolari hanno rivelato un’alta prevalenza di HPV, BV e altre STI nelle donne in età riproduttiva, sottolineando la necessità di strategie integrate di screening e prevenzione. La rilevante presenza di MCPyV, noto per il suo potenziale oncogeno, nella regione anale, specialmente nei soggetti PLWH co-infetti con HPV, richiede ulteriori approfondimenti. Modelli sperimentali come MmuPV1 possono contribuire a chiarire le alterazioni della risposta immunitaria innata osservate nell’infezione da HPV, ulteriormente modulata da comorbilità quali disbiosi e co-infezioni microbiche. Pertanto, il ripristino dell’immunità innata e il mantenimento di un microbioma sano potrebbero rappresentare strategie efficaci per prevenire la persistenza di HPV e la progressione tumorale.