Dottorato in SCIENZE CHIMICHE

Titolo della tesi: Hybrid Computational Approaches for the Elucidation of Complex Biocatalytic Mechanisms

In questo lavoro presentiamo due indagini meccanicistiche su sistemi biocatalitici di recente scoperta e di rilevanza industriale, condotte mediante un approccio computazionale ibrido che integra simulazioni QM/MM (Quantum Mechanics/Molecular Mechanics) con calcoli MD-PMM (Molecular Dynamics/Perturbed Matrix Method). Nel primo studio, riguardante la riduzione del 2-pentanone catalizzata dalla deidrogenasi alcolica del fegato di cavallo (HLADH) in presenza del cofattore biomimetico benzil-1,4-diidronicotinamide (BNAH), si propone un’innovativa ipotesi meccanicistica, basata su una pathway di tipo sequenziale. In tale percorso, un trasferimento di idruro endotermico precede un trasferimento di protone fortemente esotermico. La barriera di energia libera di Gibbs per il trasferimento di idruro, calcolata mediante MD-PMM, risulta pari a 14 kcal/mol, in eccellente accordo con il valore sperimentale. Si osserva che l’ambiente proteico contribuisce ad abbassare la barriera energetica del suddetto step reattivo rispetto alla fase gassosa. Successivamente si ipotizza un meccanismo per la fase di proton transfer in cui His51 viene protonata dal solvente circostante (bulk) e successivamente trasferisce il protone, attraverso una molecola d’acqua ponte, all’atomo di ossigeno di Ser48, da cui il protone viene poi infine ceduto al carbonile del substrato. Una o più molecole d’acqua che formano una rete di legami a idrogeno tra His51 e Ser48 risultano essenziali per l’attivazione della catena di trasferimento protonico. Il secondo studio è focalizzato sulla decarbossilasi degli acidi grassi della Chlorella Variabilis (CvFAP), un fotoenzima recentemente scoperto contenente il cofattore flavina adenina dinucleotide (FAD). CvFAP catalizza la decarbossilazione fotoindotta di acidi grassi a catena lunga in alcani. Tale reazione riveste notevole interesse per la produzione di biocarburanti. Nonostante il suo grande potenziale biotecnologico, il meccanismo di questa trasformazione è al momento solo parzialmente compreso dato che permangono incertezze riguardo allo stato di protonazione del substrato, all’origine delle caratteristiche inusuali dello spettro di assorbimento del FAD in CvFAP ,i cui segnali risultano spostati verso il rosso di circa 10–15 nm rispetto a quelli osservati in altre flavoproteine, e alla natura della specie denominata FAD_RS, che si forma dopo la decarbossilazione e si manifesta con un ulteriore spostamento verso il rosso dei picchi di assorbimento del FAD. Inoltre, si è osservato sperimentalmente che in questa proteina l’ anello isoallossazinico del FAD adotta, anche nella sua forma ossidata, una peculiare conformazione piegata (bent). I nostri calcoli QM/MM indicano chiaramente che l’acido grasso legato all’enzima è presente prevalentemente nella sua forma deprotonata. A partire da questo risultato, lo spettro di assorbimento del FAD in CvFAP è stato simulato mediante calcoli MD-PMM, i quali mostrano che il contributo derivante dalla conformazione piegata dell’ anello isoallossazinico del FAD (bending) allo spostamento verso il rosso osservato è modesto (≈4 nm), mentre l’ambiente proteico rappresenta il fattore dominante (≈15 nm). Riguardo all’origine della specie FAD_RS, i nostri calcoli supportano l’ipotesi che la sua formazione sia verosimilmente guidata da una marcata riorganizzazione del sito attivo successiva alla formazione dei prodotti (alcano, CO₂ e bicarbonato), in cui il bicarbonato interagisce fortemente con l’anello isoallossazinico del FAD. Nel complesso, i nostri risultati forniscono una solida base per la comprensione dei meccanismi di reazione di questi enzimi, offrendo approfondimenti meccanicistici utili allo sviluppo di applicazioni industriali ecosostenibili. Dal punto di vista computazionale, la tesi evidenzia inoltre la complementarità tra le metodologie QM/MM e MD-PMM, sottolineando come la loro integrazione sia essenziale per ottenere una caratterizzazione dettagliata e accurata dei meccanismi di reazione enzimatici.