Dottorato in ADVANCES IN INFECTIOUS DISEASES, MICROBIOLOGY, LEGAL
MEDICINE AND PUBLIC HEALTH SCIENCES

Titolo della tesi: Temporal and spatial profiling of Aedes albopictus immune responses to chikungunya virus (CHIKV) and characterization of a novel salivary biomarker of human exposure

Le malattie trasmesse da vettori costituiscono una sfida sanitaria di notevole rilevanza globale, rappresentando oltre il 17% delle malattie infettive e causando più di 700.000 decessi ogni anno. Tra queste, le arbovirosi – tra cui le infezioni da virus dengue (DENV), Zika (ZIKV) e chikungunya (CHIKV) – destano particolare preoccupazione per la loro elevata patogenicità e per la carenza di efficaci misure di prevenzione e trattamento. Aedes aegypti e Aedes albopictus rappresentano oggi i principali vettori di questi patogeni, e la rapida espansione su scala globale di Ae. albopictus ne accentua la sua pericolosità per la salute pubblica. A seguito dell’ingestione di un pasto di sangue viremico, la zanzara si infetta e il virus, una volta al suo interno, deve superare diverse barriere anatomiche e immunitarie per potere sopravvivere ed essere trasmesso a un successivo ospite vertebrato. Nonostante l’assenza di un sistema immunitario adattativo, le zanzare sono in grado di attivare una complessa risposta immunitaria contro il patogeno, evidenziando l’importanza di approfondire le dinamiche di interazione vettore-virus, che possono fornire nuovi spunti per lo sviluppo di efficaci strategie di controllo vettoriale. Negli ultimi anni, anche lo studio delle interazioni tra vettore e ospite vertebrato è stato oggetto di numerose ricerche, aprendo la strada allo sviluppo di una nuova metodica che consente di monitorare l’esposizione umana all’attività vettoriale, e quindi il rischio di trasmissione arbovirale, attraverso la misurazione diretta della risposta anticorpale a specifici antigeni salivari iniettati durante il pasto di sangue. Nel presente elaborato vengono presentate due ricerche condotte durante il mio percorso di dottorato, entrambe incentrate sul vettore Aedes albopictus. Il capitolo 1, intitolato “Temporal and spatial profiling of Aedes albopictus immune responses to chikungunya virus (CHIKV) infection”, analizza le variazioni trascrizionali che si verificano nella zanzara Ae. albopictus in risposta all’infezione con il virus chikungunya (CHIKV). Lo studio si concentra su due momenti chiave di questa interazione: (i) un giorno dall’infezione, nell’intestino medio, corrispondente alla fase iniziale in cui la zanzara attiva la prima risposta immunitaria dopo l’ingresso del virus; e (ii) cinque giorni dall’infezione, nell’emocele, rappresentante una fase più tardiva durante la quale il virus dissemina nell’emolinfa, innescando una seconda ondata immunitaria mediata dagli emociti e dalle cellule dei corpi grassi. A tal fine, femmine adulte di Ae. albopictus sono state infettate con CHIKV e, a uno e cinque giorni dall’infezione, intestini e carcasse (private di intestini) sono stati analizzati tramite RNAseq, utilizzando zanzare nutrite con sangue non infetto come controlli. I risultati hanno evidenziato che l’intestino medio svolge un ruolo cruciale nella fase iniziale, attivando pathways immunitari quali RNA interference, autofagia e ubiquitinazione, e modulando importanti processi metabolici. Nella fase più tardiva, dopo la disseminazione virale nell’emocele, predominano risposte immunitarie sistemiche, tra cui l’attivazione di recettori immunitari, la secrezione di peptidi antimicrobici e la melanizzazione. La validazione tramite RT-qPCR di alcuni geni identificati dall’analisi di RNA-seq ha confermato il profilo di espressione osservato. Questa analisi trascrittomica fornisce una mappa dettagliata e temporo-tessuto-specifica delle risposte molecolari di Aedes albopictus all’infezione da CHIKV. Nel capitolo 2 del presente elaborato, intitolato “A novel biomarker of human exposure to Aedes albopictus based on the Ag5-3 salivary protein from the tiger mosquito”, viene presentata una ricerca finalizzata alla validazione dell’antigene salivare alAg5 come marcatore di esposizione umana alle punture di Ae. albopictus, mediante l’impiego della metodica immunoenzimatica ELISA. In un precedente lavoro condotto presso il nostro laboratorio (Buezo Montero et al., 2020), era stata analizzata con promettenti risultati la proteina salivare al34k2. A tal fine, nel 2017 era stato condotto un campionamento di sieri provenienti da donatori sani residenti in due aree della regione Veneto (Italia), Padova e Belluno, in due momenti distinti: prima dell’estate, corrispondente a un periodo di bassa attività del vettore, e dopo la stagione estiva, quando l’esposizione alle punture di zanzara raggiunge il suo picco. Questi due siti presentano differenze nella densità e nei tempi di colonizzazione della specie Ae. albopictus, e nella copresenza di più zanzare del genere Aedes. In parallelo, nello stesso periodo, sono stati raccolti dati di sorveglianza entomologica relativi alle due aree analizzate. Utilizzando tali sieri, il presente studio ha misurato la risposta anticorpale umana verso la proteina salivare alAg5-3, singolarmente o in combinazione con al34k2. I risultati hanno indicato che alAg5-3 è più immunogenica di al34k2, consentendo di rilevare variazioni nell’esposizione umana. I risultati hanno inoltre mostrato che i livelli di IgG anti-alAg5-3 aumentano significativamente dopo l’estate, mentre differenze tra le due aree sono state rilevate solo combinando i due antigeni, suggerendo che la loro associazione rifletta meglio le variazioni spaziali e temporali. Studi futuri potranno fornire maggiore conoscenza in merito alla specie- o genere-specificità di alAg5-3. In conclusione, entrambi gli studi contribuiscono ad ampliare la comprensione della complessa interazione vettore-patogeno-ospite umano, offrendo nuove prospettive per migliorare le attuali strategie di controllo vettoriale e di sorveglianza delle arbovirosi.