Phd in MOLECULAR MEDICINE

Thesis title: CARDIOMIOCITI E NEURONI DIFFERENZIATI DA CELLULE STAMINALI PLURIPOTENTI CON MUTAZIONI DEL DNA MITOCONDRIALE: UN MODELLO PER L’ANALISI DELLA TESSUTO-SPECIFICITA’ DEI DIFETTI MITOCONDRIALI E DELL’EFFETTO DI NUOVE MOLECOLE TERAPEUTICHE

Introduzione: Le mutazioni nei geni che codificano per i tRNA mitocondriali (mt-tRNA) sono responsabili di una vasta gamma di patologie multi-sistemiche, che coinvolgono principalmente gli organi a maggior fabbisogno energetico e per le quali ad oggi non esistono terapie efficaci. Tra i fattori che limitano in misura maggiore l’individuazione di terapie mirate vi sono la scarsità di modelli animali in grado di riprodurre gli effetti delle mutazioni del DNA mitocondriale (mtDNA) e la difficoltà di veicolare molecole terapeutiche all’interno della matrice mitocondriale. Nonostante queste problematiche, sono diversi gli approcci terapeutici in via di sviluppo. Nell’ambito delle malattie dovute a mutazione nei mt-tRNA negli ultimi anni è stato investigato il ruolo delle aminoacil-tRNA sintetasi (aaRS) evidenziando, sia in lievito che in cellule umane, una loro capacità cross-soppressiva nei confronti delle mutazioni di diversi mt-tRNA. In particolare, nel nostro laboratorio abbiamo studiato il ruolo della leucil-tRNA sintetasi (LeuRS) in cibridi portatori della mutazione m.3243A>G sul mt-tRNALeu(UUR) (che causa la sindrome MELAS) e portatori della mutazione m.8344A>G sul mt-tRNALys (responsabile della sindrome MERRF). Abbiamo dimostrato che la capacità della sintetasi di migliorare il fenotipo patologico risiede in due coppie di foglietti beta, β30_31 e β32_33, derivati dalla sua porzione carbossi-terminale (Cterm) (Perli et al., 2014; 2016). I nostri risultati sono stati condotti utilizzando il modello dei cibridi transmitocondriali. I cibridi, infatti, sono un ottimo strumento per gli studi pilota, poiché facilmente manipolabili e poco costosi. Tuttavia, non riproducono interamente il fenotipo biochimico osservato nei tessuti maggiormente colpiti dai pazienti, per questo vi è la necessità di un modello cellulare più appropriato. Negli ultimi anni la differenziazione in cellule adulte a partire da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) ottenute da pazienti, ha aperto una nuova strada per lo studio della tessuto-specificità delle malattie mitocondriali. Le iPSCs rappresentano un’enorme risorsa sia per lo studio dei meccanismi patogenetici di queste malattie sia per lo sviluppo di nuove molecole terapeutiche. Scopo: Lo scopo generale del lavoro relativo alla mia tesi è stato quello di avvicinare all’applicazione clinica le molecole sviluppate nel nostro laboratorio a partire dalla porzione carbossi-terminale di mt-LeuRS attraverso la produzione di un modello cellulare in grado di ricapitolare la tessuto-specificità delle mutazioni a carico dei tRNA mitocondriali. Risultati: 1. Individuazione di modelli cellulari in grado di ricapitolare l’effetto tessuto-specifico delle principali mutazioni a carico dei tRNA mitocondriali. Nell’arco del mio Corso di Dottorato ho sviluppato iPSCs a partire da fibroblasti di pazienti portatori delle mutazioni m.3243A>G e m.8344A>G con percentuali variabili di eteroplasmia. Dopo aver caratterizzato le colonie ottenute, dimostrando l’espressione di geni embrionali, verificando il livello di mutazione specifica delle colonie, confermando l’assenza di ulteriori mutazioni e riarrangiamenti del mtDNA e osservando la capacità delle colonie di differenziare nei tre foglietti embrionali, abbiamo selezionato i cloni di nostro interesse e abbiamo prodotto cellule staminali neurali e cardiomiociti indotti. In seguito, mediante analisi di immunofluorescenza, abbiamo studiato il fenotipo delle cellule ottenute e valutato il loro assetto genetico, dimostrando che le cellule differenziate mutate presentano un fenotipo patologico. In particolare, le cellule neurali MELAS sono caratterizzate da un deficit delle subunità della catena respiratoria mitocondriale e i cardiomiociti MELAS hanno una cinetica dei transienti di calcio ed una durata del potenziale d’azione più veloce rispetto ai controlli. Questi risultati sono molto promettenti dal momento che ci permettono di poter avere a disposizioni cellule differenziate patologiche utili per dettagliare i meccanismi alla base della tessuto-specificità di queste mutazioni e adatte per testare le nostre molecole terapeutiche. 2. Messa a punto di costrutti ad azione terapeutica in grado di penetrare nelle cellule e nella matrice mitocondriale. Negli ultimi anni abbiamo dimostrato, attraverso esperimenti di trasfezione cellulare, che due peptidi derivati dal Cterm della LeuRS (β30_31 e β32_33) recuperano il fenotipo patologico in cibridi mutati. Al fine di avvicinare queste molecole a possibili applicazioni terapeutiche è necessario verificare che queste siano in grado di per sé di penetrare nelle cellule. A questo scopo, abbiamo progettato e testato diversi costrutti derivati dal peptide β32_33 verificandone la localizzazione e l’effetto. I risultati ottenuti hanno evidenziato che solo i costrutti contenti la sequenza corretta del peptide β32_33 (sia in termini di ordine amminoacidico che in termine di carica positiva complessiva) sono in grado di migliorare in modo significativo il fenotipo delle cellule mutate MELAS e MERRF. L’insieme di questi risultati apre importanti prospettive per future applicazioni terapeutiche