Titolo della tesi: Validation of an Internal Method for the interpretation of mixed genetic profiles and validation of a Probabilistic Genotyping Software within the Forensic Genetics Laboratory of the Forensic Scientific Police Service
La presente ricerca di dottorato si concentra sulla validazione di un metodo interno per l'analisi di profili di DNA misti e sull'implementazione di un software di genotipizzazione probabilistica (PGS) all'interno del Laboratorio di Genetica Forense del Servizio di Polizia Scientifica di Roma. Il progetto risponde alla crescente necessità di estendere l'accreditamento ISO/IEC 17025 del laboratorio, precedentemente limitato ai profili di DNA provenienti da un'unica fonte, all'analisi di profili misti, sempre più comuni nei casi forensi grazie ai progressi nel recupero del DNA da campioni biologici degradati o a basso contenuto di DNA.
La ricerca è stata sviluppata in due fasi principali. La prima riguardava la validazione del flusso di lavoro analitico completo per l'interpretazione di profili genetici misti che coinvolgono due e tre contributori. In laboratorio sono state preparate miscele ad hoc utilizzando tamponi buccali di individui selezionati, garantendo composizioni alleliche e rapporti di miscelazione definiti. Questi campioni sono stati analizzati utilizzando il kit di amplificazione PCR GlobalFiler™, l'elettroforesi capillare sull'analizzatore genetico Applied Biosystems 3500 e il software GeneMapper® ID-X, in conformità con le procedure interne. Lo studio ha anche verificato se i valori delle soglie analitiche validate per i profili singoli potessero essere estesi ai profili misti. I risultati hanno confermato l'adeguatezza delle soglie preesistenti che erano state validate, comprendendo sia le soglie a basso template (LT-DNA) che le soglie dei campioni convenzionali (cDNA).
La fase successiva ha riguardato la validazione del software di genotipizzazione probabilistica, con l'obiettivo di integrare l'interpretazione classica dei profili misti, basata sull'esperienza degli esperti, con una valutazione probabilistica oggettiva, basata sul rapporto di verosimiglianza (LR). A seguito di una valutazione comparativa tra modelli semi-continui e continui (in particolare LRmixStudio, STRmix™ ed EuroForMix), quest'ultimo è stato identificato come il più appropriato per le esigenze operative del laboratorio. EuroForMix è stato quindi sottoposto a un accurato processo di validazione interna in conformità con le raccomandazioni SWGDAM (2015) al fine di valutarne le prestazioni e i limiti. I set di dati di validazione includevano miscele generate in laboratorio, campioni in silico derivati dal database PROVEDIt e casi forensi reali, che rappresentavano l'intera gamma di complessità riscontrate nella pratica.
Gli studi di validazione hanno esaminato l'affidabilità, la precisione, la sensibilità e la specificità. Analisi ripetute hanno dimostrato un'elevata riproducibilità dei valori LR. Le valutazioni di sensibilità hanno confermato la robustezza del software anche in casi di profili parziali o effetti stocastici per i contributori reali, mentre i test di specificità hanno verificato che i non contributori producevano costantemente valori LR inferiori a 1, riducendo così al minimo le false inclusioni.
I risultati dei test di sensibilità e specificità hanno dimostrato che il software EuroForMix è ben calibrato.
Questo studio ha dimostrato che, sebbene gli strumenti PGS debbano essere considerati come ausili complementari piuttosto che sostitutivi del giudizio degli esperti, l'integrazione della validazione sperimentale e degli approcci probabilistici può migliorare la qualità e la trasparenza delle analisi genetiche forensi, grazie a un'interpretazione migliore e più accurata dei profili genetici complessi.