Thesis title: Ruolo della biopsia liquida nello studio dell'evoluzione clonale del carcinoma del colon-retto RAS mutato
Ruolo della biopsia liquida nello studio dell'evoluzione clonale del carcinoma del colon-retto RAS mutato
INTRODUZIONE
La realtà molecolare complessa e eterogenea del carcinoma metastatico del colon-retto, ha messo in evidenza le principali problematiche ed i limiti della biopsia tissutale, ancora oggi utilizzata per la valutazione dello stato mutazionale del tumore. La biopsia liquida, in questo contesto, costituisce una possibile valida alternativa per l’ottenimento di analisi più complete, sia dal punto di vista spaziale che temporale, del campione tumorale. Le terapie biologiche dirette in particolare contro il pathway di EGFR rappresentano ad oggi lo standard di cura nei pazienti con tumori RAS-wild-type e l’analisi dello stato mutazionale del tumore, attualmente eseguita su tessuto, è premessa necessaria per escludere la presenza di mutazioni predittive di resistenza innata alla terapia. E’ oggi altresì noto che pazienti con tumori metastatici del colon-retto che inizialmente rispondono alla terapia con anticorpi monoclonali anti-EGFR possano sviluppare resistenza acquisita al trattamento, attribuibile nella metà dei casi almeno alla comparsa di mutazioni di RAS. Tali mutazioni possono essere monitorate nel sangue dei pazienti con tumore del colon-retto prima che la progressione della malattia si manifesti clinicamente. Utilizzando proprio la biopsia liquida è stato dimostrato che pazienti con CRC RAS wild-type, in seguito a trattamento con anticorpi monoclonali anti-EGFR, sviluppano mutazioni nei geni RAS. Alterazioni molecolari in altri geni potenzialmente coinvolti nella resistenza ai farmaci anti-EGFR sono state anche dimostrate in questi pazienti attraverso biopsia liquida. Pertanto, questi risultati sembrano indicare che la biopsia liquida possa effettivamente consentire di individuare i meccanismi che portano il tumore a sviluppare resistenza ai farmaci a bersaglio molecolare. Scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di indagare attraverso biopsia liquida l’evoluzione clonale del carcinoma del colon-retto RAS mutato in corso di trattamento, con particolare attenzione al fenomeno biologico recentemente descritto della perdita di mutazioni di RAS/BRAF al momento della progressione di malattia.
PAZIENTI, MATERIALI E METODI
Sono stati inclusi nel presente studio 45 pazienti, con diagnosi istopatologica di carcinoma metastatico del colon-retto ed evidenza di mutazione dei geni RAS/BRAF su tessuto primitivo o sul tessuto metastatico . L’analisi mutazionale dei geni RAS/BRAF su tessuto tumorale è stata eseguita, come parte del percorso diagnostico di routine, mediante metodo Sanger o Ion Torrent Personal Genome Machine (IT-PGM). Un prelievo di sangue è stato ottenuto per l’analisi del ctDNA prima di iniziare la terapia sistemica, di qualunque linea, e ad ogni rivalutazione clinica e/o strumentale di malattia, fino alla progressione.Il rilevamento delle mutazioni nei geni oncogeni RAS e BRAF su plasma è stato effettuato tramite un saggio di PCR real time. Per confermare la presenza di ctDNA nel campione di plasma abbiamo utilizzato e comparato l’analisi in NGS ed un saggio di metilazione specifico per cancro del colon-retto già validato in biopsia liquida.
RISULTATI
Sono stati inclusi nel presente studio 45 pazienti, tutti con diagnosi istopatologica di carcinoma metastatico del colon-retto ed evidenza di mutazioni nei geni RAS su tessuto tumorale primitivo o sulle metastasi. È stato effettuato uno studio di concordanza dello stato mutazionale dei geni RAS/BRAF tra plasma e tessuto prima dell’inizio della terapia sistemica. 5 casi, nei quali il plasma non mostrava mutazioni di RAS al basale, mostrando quindi discordanza con il tessuto, sono stati esclusi dallo studio. I 40 pazienti arruolati sono stati sottoposti ad analisi seriali del ctDNA con prelievi effettuati ad ogni rivalutazione clinico-strumentale di malattia fino alla progressione.
Al momento della progressione di malattia: in 18/40 (45%) pazienti l’analisi mutazionale su plasma ha mostrato assenza di mutazioni di RAS/BRAF, analisi pertanto refertata dallo strumento come RAS/BRAF wt. Al contrario, in 22/40 (55%) l’analisi su plasma ha mostrato la presenza di mutazioni. Sui 18 pazienti con ctDNA RAS/BRAF wt, abbiamo condotto ulteriori analisi allo scopo di valutare se lo stato wt fosse legato ad una vera conversione dello stato mutazionale o, diversamente, da insufficiente quantità di ctDNA nel campione. Al fine di verificare che l’assenza di mutazioni di RAS su plasma al momento della progressione di malattia non fosse legato ad una quantità insufficiente di ctDNA rilasciato nel plasma, abbiamo analizzato i 18 campioni di ctDNA risultati RAS/BRAF wild-type al momento della progressione di malattia con un pannello NGS specifico per cancro del colon .
In 11/18 casi abbiamo potuto identificare almeno una mutazione somatica diversa da RAS nel ctDNA; questi pazienti sono stati classificati come veri “RAS converters”, ad indicare che l’assenza di mutazioni di RAS/BRAF era associata a presenza di quantità sufficiente di ctDNA, come dimostrato dalla presenza di altre mutazioni somatiche nel campione. Al contrario, in 7/18 casi (38,9%) l’analisi in IT-PGM non ha evidenziato alcuna mutazione somatica, a suggerire la scarsa sensibilità del metodo di biopsia liquida verosimilmente legata alla scarsa quantità di ctDNA rilasciata in circolo. Questi pazienti sono stati classificati come “non- shedders”. Considerando pertanto la popolazione iniziale di pazienti, e utilizzando IT-PGM come metodica di conferma della presenza di ctDNA nel campione, abbiamo pertanto stimato che la conversione ad uno stato RAS/BRAF wt su plasma si verifica nel 27.5% dei casi.
Ad ulteriore conferma che l’assenza di mutazioni di RAS su plasma non fosse legata ad una quantità insufficiente di ctDNA, abbiamo analizzato i 18 campioni di ctDNA risultati RAS/BRAF wild-type al momento della progressione di malattia con un saggio di metilazione utilizzando un pannello di geni specificamente metilati nel cancro del colon (EYA4, GRIA4, ITGA4, MAP3K14-AS1, MSC). In 10/18 casi (55,5%) abbiamo potuto identificare metilazione nel ctDNA; questi pazienti sono stati classificati come veri “RAS converters”. Al contrario, in 8/18 casi (44,5%) l’analisi di metilazione ha dato esito negativo, a suggerire che in questi pazienti la quantità di ctDNA nel sangue era scarsa o assente (pazienti non- shedders). Considerando pertanto la popolazione iniziale di pazienti, e utilizzando l’analisi di metilazione come metodica di conferma della presenza di ctDNA nel campione, abbiamo stimato che il tasso di conversione della mutazione di RAS/BRAF su plasma è pari al 25%. Una concordanza tra le due metodiche è stata osservata in 17/18 casi (94,4%). Gli 11 pazienti che mostravano al momento della progressione di malattia un assetto mutazionale RAS/BRAF wt su plasma, sono stati considerati a tutti gli effetti pazienti con neoplasia del colon RAS/BRAF wild- type. Di questi, 8 hanno acconsentito ad entrare in uno studio sperimentale per valutare l’efficacia degli inibitori di EGFR in combinazione con chemioterapia standard, ottenendo una PFS media di 10, 7 e 6 mesi in seconda, terza e quarta linea terapeutica rispettivamente.
DISCUSSIONE
Il fenomeno biologico della selezione negativa dei cloni RAS mutati nell’evoluzione clonale dei tumori del colon retto è ad oggi oggetto di interesse e di controversie. Infatti, se da una parte la possibilità di candidare pazienti con tumori RAS mutati al trattamento con inibitori di EGFr basandosi sulla biopsia liquida sembra un’opzione interessante, dall’altra il fenomeno della clearance della mutazione di RAS è riportato in letteratura in una percentuale di pazienti variabile dal 6 al 70% a seconda degli studi. Se quindi la possibilità di inserire un trattamento con inibitori di EGFR in pazienti che secondo linee guida non potrebbero beneficiarne sembra un’ipotesi percorribile, soprattutto in considerazione della prognosi infausta di questo gruppo di pazienti, bisogna però considerare che molte delle metodiche attualmente a disposizione in biopsia liquida sono caratterizzate da bassa sensibilità, e resta pertanto cruciale distinguere i casi caratterizzati da reale selezione negativa dei cloni RAS mutati da quelli in cui non c’è rilascio di ctDNA. Infatti, le possibilità di successo dell’analisi della biopsia liquida sono legate alla quantità di ctDNA presente nel sangue periferico, che possono limitare in maniera significativa la sensibilità del test. Nonostante lo sviluppo di nuove tecniche di NGS in grado di rilevare mutazioni in biopsia liquida con un MAF <1%, i principali problemi associato alla analisi del ctDNA con NGS sono rappresentati dalla necessità di conoscere il profilo mutazionale del tumore primitivo, e dalla possibilità di falsi positivi dovuti ad artefatti di sequenza, che sono relativamente frequenti per varianti a bassa frequenza allelica, e che possono essere dovuti a mutazioni associate ad emopoiesi clonale. Un valido approccio alternativo, che prescinde dalla conoscenza di mutazioni somatiche del tumore è l’individuazione di modifiche epigenetiche, come la metilazione. In questo lavoro di tesi, allo scopo di confermare la presenza di ctDNA nei campioni di plasma caratterizzati da assenza di mutazioni di RAS, e potere pertanto candidare pazienti ad un trattamento con inibitori di EGFR, abbiamo comparato le due metodiche: la next generation sequencing, utilizzando un pannello colon-specifico, e l’analisi della metilazione, utilizzando un pannello innovativo specifico per cancro del colon e caratterizzato da elevata sensibilità in biopsia liquida. Nonostante la concordanza tra le due metodiche sia risultata elevata, riteniamo di avere identificato alcuni vantaggi del saggio di metilazione rispetto all’analisi in NGS. Le modificazioni epigenetiche, in generale, sono considerate come un evento precoce nella carcinogenesi e, quindi, potrebbero essere un marcatore adatto per la diagnosi precoce. Inoltre, l’identificazione delle modificazioni epigenetiche in modo non invasivo attraverso biopsia liquida potrebbe fornire un approccio efficace, nella definizione della prognosi, e nel monitoraggio della malattia minima residua così come dell’efficacia dei trattamenti.