Dottorato in BIOLOGIA AMBIENTALE ED EVOLUZIONISTICA

Titolo della tesi: Development of new cost-effective assays for monitoring oxidative stress in model organisms exposed to particulate matter in in-vivo controlled conditions

Questo studio intende contribuire allo sviluppo di un metodo innovativo per valutare lo stress ossidativo indotto dal particolato atmosferico (PM) utilizzando organismi modello in vivo, sia in condizioni controllate di laboratorio che in condizioni reali. (A) Dato l'approccio innovativo di questo progetto, durante la ricerca di dottorato è stata condotta un'ampia ricerca in letteratura, che ha portato a una revisione scientifica dei metodi di valutazione dello stress ossidativo indotto dal PM (documento A1). Sono stati riassunti i metodi per la valutazione dell'OP mediante saggi acellulari e sono stati evidenziati i loro limiti. Successivamente, sono stati descritti i metodi basati sull'applicazione in vitro di tecniche cellulari, citando i principali modelli cellulari utilizzati per studiare gli effetti avversi indotti dal PM e descrivendo i principali saggi e marcatori di stress ossidativo. Infine, un'attenzione particolare e una revisione sistematica della letteratura sono state dedicate ai lavori che prevedono l'uso di organismi modello/sperimentali per studiare gli effetti dello stress ossidativo indotto dal PM, evidenziando la possibilità di applicare tali tecniche sia in condizioni di laboratorio che di esposizione reale, proponendo questo tipo di applicazione come una prospettiva futura per lo studio degli effetti dello stress ossidativo indotto dal PM. (B) Ad oggi, il potenziale ossidativo del PM viene valutato principalmente attraverso l'applicazione di saggi di potenziale ossidativo acellulare. In generale, i saggi OP più applicati sul PM sono: Acido ascorbico (OPAA), ditiotreitolo (OPDTT) e 2,7-diclorofluoresceina (OPDCFH). L'associazione tra questi tre saggi e i costituenti del PM è stata studiata (articolo B1) attraverso l'applicazione di una campagna di campionamento per ottenere campioni da un'area mista urbano-industriale in cui era presente un'industria di lavorazione del ferro e del manganese. Sono stati ottenuti campioni anche da un secondo sito di tipo urbano ed è stata applicata un'analisi ICP-MS per la caratterizzazione chimica delle frazioni solubili e insolubili del PM. Infine, la frazione solubile del PM è stata associata ai risultati dei saggi OP e alle fonti di emissione locali attraverso l'applicazione dell'analisi statistica multivariata (ad esempio, l'analisi delle componenti principali PCA). (C) Data l'importanza emergente e le prospettive offerte dall'uso di organismi modello in vivo, è stata esplorata la possibilità di utilizzare l'organismo vegetale modello Arabidopsis thaliana per studiare gli effetti dello stress ossidativo indotto dal PM (articolo C1). Le piantine di A. thaliana sono state esposte a sospensioni acquose contenenti due tipi di polvere (materiale certificato NIST1648a di polvere urbana e campioni reali di PM2,5) a diverse concentrazioni e sono state effettuate analisi qualitative e quantitative per valutare la produzione di anione super ossido (-O2-) come proxy dello stress ossidativo utilizzando il saggio del nitro blu tetrazolo (NBT). Inoltre, sulle piantine esposte al NIST1648a è stata effettuata un'analisi per valutare il contenuto di clorofilla totale e un'analisi di bioaccumulo per valutare quali elementi fossero maggiormente bioaccumulati e inducessero stress. (D) Lo stress ossidativo indotto da componenti selezionati del PM è stato valutato anche sulla specie animale sperimentale Aedes albopictus (carta D1). La polvere di freno (BD), uno dei contributi più pericolosi al PM nelle aree urbane, è stata estratta mediante sonicazione e aggiunta a diverse concentrazioni in un mezzo acquoso; le uova di Aedes albopictus sono state fatte schiudere nel mezzo acquoso contenente la BD e sono state valutate la sopravvivenza larvale, la presenza di alterazioni comportamentali (ad esempio, fenomeni di cannibalismo) e lo sviluppo. Per la valutazione dello stress ossidativo, è stata valutata l'espressione genica di due enzimi chiave nella risposta allo stress ossidativo (superossido dismutasi - SOD - e catalasi) ed è stato misurato il bioaccumulo di elementi da parte delle larve di Ae. albopictus. I risultati del bioaccumulo sono stati combinati con quelli dello stress ossidativo attraverso l'applicazione di tecniche statistiche multivariate (PCA) per identificare gli elementi maggiormente correlati allo stress ossidativo nella specie sperimentale Ae. albopictus. Infine, sono state eseguite analisi morfologiche (forma e dimensioni delle ali) su individui che hanno raggiunto lo stadio adulto per identificare eventuali alterazioni indotte dalla presenza di BD durante la crescita e lo sviluppo degli individui. (E) Nell'ultima parte del lavoro sperimentale, con l'obiettivo di passare da un'esposizione in condizioni di laboratorio a un'esposizione sul campo, sono state svolte una serie di attività che si propongono come attività in corso e prospettive future. Per queste attività è stato scelto l'organismo modello animale Drosophila melanogaster, dato il maggior potere rappresentativo delle specie modello rispetto alle specie sperimentali (es. Ae. Albopictus). Gli individui di D. melanogaster sono stati esposti in condizioni di laboratorio a due diverse concentrazioni di BD con l'obiettivo di identificare la sensibilità di questa specie al PM e ottimizzare un metodo per valutare lo stress ossidativo indotto dal PM sugli organismi viventi (articolo E1, in preparazione). Il BD è stato aggiunto al cibo e posto in provette da centrifuga da 50 mL; una coppia di individui (un maschio e una femmina) è stata posta in ogni provetta e lasciata in incubazione per sei giorni con l'obiettivo di ottenere la prole. Dopo 6 giorni, la coppia di individui adulti è stata rimossa dalle provette, che sono state lasciate in incubazione per un totale di 10 giorni per consentire alle uova prodotte di schiudersi e alla prole prodotta di svilupparsi in adulti. Al termine dei 10 giorni, la prole adulta è stata rimossa dalle provette e conservata a -80o C per evitare la degradazione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS). Lo stress ossidativo è stato valutato mediante l'applicazione del saggio NBT per la quantificazione della produzione di -O2- e le alterazioni metaboliche sono state valutate mediante analisi di risonanza magnetica nucleare (NMR) non mirata. È stata inoltre condotta un'analisi di bioaccumulo per valutare gli elementi maggiormente bioaccumulati dagli individui esposti a BD. Ulteriori analisi riguarderanno la determinazione della SOD e della catalasi e l'analisi statistica dei risultati. Infine, con l'obiettivo di passare dal laboratorio al campo, individui di D. melanogaster sono stati esposti in situ in due luoghi di lavoro gravemente impattati, come un impianto di fusione e lavorazione dei metalli e un'azienda di produzione di ceramiche artistiche, per valutare lo stress ossidativo indotto dal PM prodotto in questi particolari luoghi di lavoro. L'uso di organismi modello per stimare l'esposizione dei lavoratori può essere di grande impatto nel campo della sicurezza sul lavoro. Per la prima esposizione (articolo E2, in preparazione) sono stati selezionati quattro siti all'interno di un impianto di fusione e lavorazione dei metalli, ciascuno rappresentativo di un diverso processo produttivo (sala riunioni, laminazione a caldo, recupero delle polveri e lucidatura); in ogni sito sono stati esposti circa mille individui adulti e l'esposizione è durata 24 ore. Per la valutazione dello stress ossidativo, è stato condotto il test NBT e sarà valutata l'espressione genica degli enzimi antiossidanti SOD e catalasi. Inoltre, è stata eseguita un'analisi di bioaccumulo per valutare la capacità di questa specie di bioaccumulare elementi dal PM e l'analisi metabolomica NMR ha evidenziato una significativa alterazione metabolica dovuta all'esposizione in ciascun sito. Inoltre, durante il periodo di esposizione sono stati effettuati campionamenti di PM10 e i campioni ottenuti sono stati sottoposti a caratterizzazione chimica per il contenuto di elementi e alla valutazione dell'OP. Anche in questo caso, le relazioni causa-effetto sono state studiate con metodi statistici multivariati avanzati. Per la seconda esposizione (articolo E3, in preparazione) sono stati selezionati quattro siti all'interno dell'azienda produttrice di ceramiche artistiche; anche in questo caso sono stati esposti circa mille individui adulti e il tempo di esposizione è stato di 7 giorni. Sono state effettuate analisi per valutare lo stress ossidativo indotto dal PM e il bioaccumulo di elementi sugli individui esposti all'interno della fabbrica. Anche in questo caso, il PM10 è stato campionato per valutare il suo contenuto di elementi e per valutare l'OP. Saranno condotte ulteriori analisi per valutare l'espressione degli enzimi antiossidanti e i profili metabolomici.