Dottorato in ADVANCES IN INFECTIOUS DISEASES, MICROBIOLOGY, LEGAL
MEDICINE AND PUBLIC HEALTH SCIENCES

Titolo della tesi: Impact of Anisakis Extracellular Vesicles on Human Intestinal Organoids: a Characterization and Functional study

Background Anisakis è un genere di nematodi parassiti in grado di causare l’anisakiasi nell’uomo. Questa zoonosi può essere trasmessa tramite il consumo di prodotti ittici crudi o poco cotti e infestati con le larve al terzo stadio (L3). La patologia si manifesta con sintomi gastrointestinali aspecifici acuti (dolore epigastrico, nausea, vomito, sanguinamento) o anche reazioni allergiche come l’orticaria o l’anafilassi. L’aumento di report di tumori del tratto gastrointestinale in comorbidità con l’anisakiasi, insieme alle crescenti prove sperimentali, ha sollevato il sospetto di un possibile potenziale tumorigenico di questi parassiti. Come molti elminti, anche Anisakis attua strategie di immunomodulazione mediate dai prodotti escreti/ secreti dalla larva, tra cui le vescicole extracellulari (EVs), importanti mediatori della comunicazione ospite-parassita. Tuttavia, il ruolo delle EVs nella patogenesi dell’anisakiasi non è ancora del tutto chiaro, così come i loro effetti a lungo termine sull’epitelio intestinale umano. Obiettivi. Questo studio ha l’obiettivo di (i) isolare e caratterizzare le EVs secrete dalle larve L3 di Anisakis con approccio multimodale e (ii) testarne l’effetto biologico su organoidi intestinali umani (HIOs). Metodi. L3 di Anisakis sono state campionate dalle cavità viscerali di specie ittiche quali naselli, sgombri e alici, e incubate in terreno di coltura per permettere il recupero delle EVs. Quest’ultime sono state isolate tramite precipitazione oppure cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) abbinata all’ultrafiltrazione. Le EVs sono state caratterizzate mediante NTA/iNTA, DLS, TRPS, TEM/SEM e AFM e le molecole esposte sulla loro superficie esterna (corona) sono state esaminate con trattamenti enzimatici a base di proteinasi K e PNGasi F. Successivamente le EVs sono state utilizzate per esplorare l’effetto sull’ospite, e applicate apicalmente a monostrati polarizzati di HIOs. Sul modello sono state eseguite le seguenti analisi: RNA-seq (mRNA/miRNome), qRT-PCR, saggi multiplex per citochine, immunofluorescenza e western blot di marcatori di giunzione e differenziamento. Risultati. La SEC abbinata all’ultrafiltrazione ha fornito frazioni arricchite in EVs più pure rispetto alla precipitazione e l’uso dell’ultrafiltrazione ha efficacemente compensato la minore resa della SEC. I risultati preliminari di caratterizzazione hanno mostrato vescicole integre e sferiche all’EM e un effetto di “shaving” dopo trattamento enzimatico. Negli HIOs, le EVs hanno indotto alterazioni significative in sette geni: l’espressione di NUPR1 e H2BC5 (stress/controllo trascrizionale) risulta aumentata, mentre l’espressione di LEFTY1, MKI67, MYBL2, TACC1 ed EPHB2 (ciclo cellulare, adesione/architettura) risulta ridotta. L’analisi bioinformatica sui possibili geni target dei microRNA parassitari veicolati dalle EVs ha identificato TACC1 ed EPHB2 tra i candidati. A livello di fattori secreti, rispetto all’epitelio non trattato le EVs hanno ridotto i livelli di IL-33R, CD40, CEACAM-1, IL-1β, GM-CSF, IL-15 e IL-23, citochine e fattori solubili coinvolti in meccanismi di difesa contro il parassita. Non si osservano alterazioni dei marker strutturali ZO-1, Villin-1 o MUC-2 negli HIOs trattati con EVs. Conclusioni. Le EVs di Anisakis rimodellano i programmi epiteliali e attenuano la produzione di citochine pro-infiammatorie. Potrebbero, inoltre, promuovere un ambiente tollerogenico e ipo-infiammatorio che, insieme alla soppressione delle vie di proliferazione/riparo, creerebbe condizioni permissive alla tumorigenesi. Questi dati definiscono una nuova piattaforma sperimentale basata su organoidi di intestino umano per studiare le interazioni Anisakis–ospite e sottolineano l’importanza delle EVs come attori chiave della comunicazione ospite–parassita all’interfaccia tra immunità, patologia e cancro.