Phd in ENDOCRINOLOGICAL SCIENCES

Thesis title: Aspetti epigenetici dello spermatozoo in condizioni fisiopatologiche

L’ infertilità si riferisce all’incapacità di concepire dopo almeno dodici mesi di rapporti non protetti durante il periodo ovulatorio della donna. Studi recenti hanno ipotizzato che danni al DNA nemaspermico, metilazione del DNA o anomalie epigenetiche possano essere contribuire l’infertilità. L'epigenetica, che include meccanismi come la metilazione del DNA e i microRNA, altera l’espressione genica senza modificare la sequenza del DNA. Diversi fattori possono provocare alterazioni epigenetiche che potrebbero influenzare la fertilità maschile. Il presente progetto di tesi si concentra su due aspetti epigenetici: l’imprinting genomico e le alterazioni epigenetiche associate all’aging. Per tale scopo, il progetto è stato suddiviso in due studi. STUDIO 1 - L'imprinting genomico è una modificazione epigenetica che regola l'espressione monoallelica di geni in base all'origine parentale. Tra i geni di interesse per l’infertilità maschile ci sono H19, IGF2 e PEG1/MEST. Questo studio ha valutato il profilo di metilazione di questi geni in relazione ai parametri seminali, alla frammentazione del DNA nemaspermico (FDS) e agli esiti riproduttivi in Procreazione Medicalmente assistita (PMA). Materiali e metodi: Sono stati raccolti campioni seminali da uomini le cui partner femminili era sottoposte a cicli di iniezione intracitoplasmatica (ICSI). Su un’aliquota eccedente il ciclo di PMA, prima della selezione nemaspermica, sono state eseguite le seguenti analisi: analisi del liquido seminale secondo WHO (2021); valutazione della %FDS mediante test TUNEL; estrazione del DNA nemaspermico eseguita con il kit Nucleospin; livelli di metilazione del DNA dello spermatozoo dei geni H19,IGF2 e PEG1/MEST mediante pirosequenziamento. Risultati: Sono stati reclutati 20 uomini, suddivisi in tre gruppi in base agli esiti ICSI: 7 soggetti avevano ottenuto embrioni evolutivi (EE), 7 soggetti avevano ottenuto embrioni non evolutivi (ENE) e 6 soggetti che non avevano raggiunto la fecondazione (NF). I parametri seminali erano superiori al 5° percentile dei valori di riferimento del WHO (2021). Si è osservata una riduzione negativa significativa della %FDS negli embrioni evolutivi (EE) rispetto agli altri gruppi. L'analisi della metilazione delle 4 isole CpG presenti nel promotore del gene H19 ha mostrato una trend di differenza nella metilazione dell’isola CpG1 H19 tra i tre gruppi. È stata inoltre identificata una correlazione positiva significativa tra la metilazione di CpG1 e l’evolutività embrionaria. L’isola CpG2 H19 ha mostrato una correlazione significativa positiva con la concentrazione nemaspermica e, nel sottogruppo di infertilità maschile/coppia, è stata riscontrata una correlazione negativa tra la metilazione totale del gene H19 e la %FDS. Sono state analizzate le tre isole CpG presenti sul gene IGF2. La percentuale di metilazione era simile tra i gruppi NF, ENE e EE. E’ stata riscontrata una correlazione positiva tra la metilazione totale e la vitalità degli spermatozoi e una negativa con la %FDS. Considerando le singole CpG island, l’isola CpG3 correlava in modo positivo e significativo con l’embrione evolutivo (p=0.027). E’ stato infine analizzato il profilo di metilazione delle delle 4 isole CpG presenti in prossimità del promotore del gene PEG1/MEST. La metilazione totale correlava positivamente con eventi di fecondazione ed embrioni evolutivi. Inoltre, le isole CpG2 e le CpG3 mostravano correlazioni con i parametri seminali. STUDIO 2 - I cambiamenti epigenetici dello spermatozoo associati all’età rappresentano un potenziale meccanismo per spiegare il declino delle caratteristiche seminali e gli esiti riproduttivi avversi all’avanzare dell’età maschile. Questo studio si proponeva di valutare eventuali cambiamenti citologici, molecolari ed epigenetici che si verificano nello spermatozoo con l’invecchiamento. Materiali e metodi: Sono stati reclutati uomini suddivisi in due gruppi di età, 17-25 anni e oltre i 40 anni. Sul campione seminale sono state eseguite: analisi del liquido seminale, analisi della frammentazione del DNA nemaspermico, valutazione dei livelli dei miRNA-34c-5p e miRNA-449b-5p negli spermatozoi e analisi della metilazione dei geni imprinted IGF-2 e PEG1/MEST. Risultati: Sono stati reclutati 45 soggetti del gruppo anziano (età 40-74 anni) e i 42 soggetti del gruppo giovane (17-27 anni). I parametri seminali erano significativamente diversi tra i due gruppi. La %FDS era maggiore nel gruppo di anziani e ha mostrato correlazione negativa con i parametri seminali. I livelli del miRNA-449b erano più elevati negli anziani rispetto ai giovani. Entrambi i miRNA-34c e miRNA-449b, si sono dimostrati associati alle caratteristiche seminale, in particolare con la concentrazione nemaspermica e la vitalità, rispettivamente. Infine, è stato evidenziata una correlazione significativa tra i miRNA-34c e miRNA-449b. Si è osservato che una maggiore metilazione del gene IGF2 era correlata con caratteristiche seminali migliori. Anche la metilazione del gene PEG1/MEST era correlata alle caratteristiche seminale. Infine, è stata osservata una relazione positiva tra la metilazione del gene PEG1/MEST e il miRNA-449 e la %FDS. In conclusione, i risultati di questi progetto evidenziano il ruolo dell'epigenetica nell'infertilità maschile. Da un lato, la conoscenza dello stato di metilazione di geni imprinted nel DNA nemaspermico potrebbe fornire informazioni sul processo di fecondazione e sviluppo embrionale, in particolare in contesti di PMA. Dall’altro lato, i risultati confermano il ruolo dell’epigenetica nell’aging e suggeriscono che, in futuro, parametri come la frammentazione del DNA nemaspermico, sperm-borne miRNA-34c e miRNA-449b e la metilazione dei geni imprinted potrebbero essere potenziali biomarcatori di qualità seminale e do sviluppo embrionale.