Dottorato in BIOLOGIA CELLULARE E DELLO SVILUPPO

Titolo della tesi: Epigenetic drugs as a pharmacological approach in Duchenne Muscular Dystrophy

ABSTRACT Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is the most severe form of dystrophy that leads to progressive muscle weakness because of a gradual replacement of functional muscle with fat and fibrotic scars. Pharmacological therapies for DMD should therefore aim to counteract this fibro-adipogenic degeneration and to promote the compensatory regeneration to slow down progression of pathology. Previous works proved pre-clinical efficacy of pan-histone deacetylase inhibitors (HDACi) in the treatment of murine models of DMD, showing the ability of HDACi to counter disease progression and to induce functional and morphological recovery. These studies paved the way for ongoing clinical trials on dystrophic boys but the use of pan-HDACi raises several concerns because of their lack of selectivity and the potential to induce adverse effects over longer period of treatment. Thus, an urgency in the field of epigenetic pharmacology is to develop more selective strategies. Other epigenetic modifiers, such as Histone Lysine Methyltransferases (KMTs) are emerging as particularly relevant in myogenesis. In particular, Histone 3 Lysine 9 (H3K9) KMTs are implicated in the dynamic control of gene expression in myogenic precursors and are highly specific for their targets. Therefore, the development of KMTs specific inhibitors might be a strategy to increase selectivity of epigenetic therapies. We aimed here to test pre-clinical efficacy of newly developed specific inhibitors for class I HDACs (I-HDACi) and H3K9 KMTs (KMTi) in murine models of skeletal muscle regeneration and DMD. We reason that modulation of these epigenetic modifiers could represent a way to promote the expression of muscle-specific genes and to enhance muscle differentiation in cells or tissues whose myogenic capacity is compromised, such as DMD. In agreement with this idea, we show here that the in vivo inhibition of H3K9 KMTs and class I HDACs efficiently promotes an overall muscle regeneration in injured wild type mice and mdx mice (the murine model for DMD). These drugs promote an increasement of myofibers’ size, and reduction of adipogenic, fibrotic and inflammatory infiltrations. Our data indicate that the pharmacological treatment with these specific epigenetic drugs might become an effective therapeutic approach to counteract the degeneration in DMD. The results of these studies will provide important insights to further develop these drugs and even to conceive future combined therapies targeting both HDACs and KMTs. ABSTRACT ITALIANO La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è la forma più grave di distrofia che porta a progressiva debolezza muscolare a causa di una graduale sostituzione del muscolo con tessuto adiposo e fibrotico non funzionale. Le terapie farmacologiche per la DMD dovrebbero quindi mirare a contrastare questa degenerazione fibro-adipogenica, promuovendo nello stesso tempo la rigenerazione compensatoria al fine di rallentare la progressione della patologia. Studi precedenti hanno dimostrato l'efficacia dell’utilizzo di pan-inibitori delle istone deacetilasi (HDACi) nel trattamento di modelli murini di DMD, mostrando la capacità degli HDACi nel contrastare la progressione della malattia e indurre il recupero funzionale e morfologico. Queste evidenze hanno aperto la strada a studi preclinici su ragazzi distrofici, ma l'uso di pan-HDACi solleva diverse controversie a causa della loro mancanza di selettività e della possibilità di avere effetti collaterali per periodi di trattamento più lunghi. Pertanto, lo sviluppo di strategie più selettive sta diventando cruciale nel campo della farmacologia epigenetica. Altri modificatori epigenetici, come le lisina metiltransferasi (KMT) stanno emergendo come particolarmente rilevanti nella miogenesi, essendo altamente specifici per precise lisine ed essendo implicati nel controllo dell'espressione genica nei precursori miogenici. Lo sviluppo di inibitori specifici delle KMTs potrebbe quindi essere una valida strategia per aumentare la selettività delle terapie epigenetiche. Il nostro studio mira a testare l'efficacia pre-clinica di nuovi inibitori specifici per HDAC di classe I (I-HDACi) e le KMTs della lisina 9 dell’istone H3 (H3K9) (KMTi) in modelli murini di rigenerazione del muscolo scheletrico e di DMD. La nostra ipotesi è che la modulazione di questi modificatori epigenetici possa rappresentare un modo per promuovere l'espressione di geni specifici del muscolo e migliorare il differenziamento muscolare in cellule, o tessuti, la cui capacità miogenica è compromessa, come nella DMD. I dati ottenuti evidenziano un effetto pro-rigenerativo di questi inibitori in vivo. Infatti, l'inibizione delle H3K9 KMT e delle HDAC di classe I promuove la rigenerazione muscolare sia in topi wild type che in topi mdx (modello murino per la DMD). I muscoli trattati mostrano un aumento dell’area delle miofibre, ed allo stesso tempo, una riduzione dell'infiltrato adipogenico e fibrotico, oltre che dell’infiammazione. I dati ottenuti suggeriscono che il trattamento farmacologico con questi specifici farmaci epigenetici potrebbe diventare un efficace approccio terapeutico per contrastare la degenerazione nella DMD. I nostri risultati potranno quindi fornire importanti indicazioni per sviluppare ulteriormente questi farmaci e potenzialmente concepire future terapie combinate indirizzate sia all’inibizione di specifiche HDACs che KMTs.