Dottorato in MEDICINA MOLECOLARE

Titolo della tesi: Lymph node micrometastases in OSCC: molecular profiling of histologically negative lymph nodes for prognostic and therapeutic purposes

Background: Il carcinoma squamoso del cavo orale (OSCC) in stadio precoce (pT1–pT2, pN0) rappresenta una quota significativa dei tumori della cavità orale. Nonostante il trattamento chirurgico primario, fino al 30% dei pazienti in stadio precoce va incontro a recidiva, anche in presenza di linfonodi istologicamente negativi. Questo studio ha indagato se l’analisi molecolare, esaminando lo stato mutazionale dei geni più frequentemente alterati nel carcinoma orale e l’espressione di specifici miRNA, possa rilevare una disseminazione occulta e migliorare la stratificazione del rischio. Methods: Le mutazioni somatiche identificate mediante sequenziamento dell’esoma (WES) nei tumori primitivi di una coorte di OSCC in stadio precoce sono state utilizzate come marcatori specifici per paziente. La digital PCR è stata successivamente applicata ai linfonodi istologicamente negativi di pazienti recidivanti (n=13) e non recidivanti (n=6). Come controlli, sono stati utilizzati tessuti tumorali e linfonodi metastatici (N+) di un sottogruppo di 4 pazienti con OSCC in stadio avanzato (pN>0). Inoltre, un set di 4 miRNA, precedentemente identificato come prognostico nei tumori testa-collo, è stato valutato tramite qPCR nelle stesse coorti tissutali e integrato con lo stato mutazionale. Infine, per migliorare la stratificazione del rischio, lo stato mutazionale e l’espressione dei miRNA sono stati valutati longitudinalmente anche in campioni di biopsia liquida (saliva e sangue) raccolti in fase pre- e post-chirurgica da tre pazienti recidivanti. Results: L’analisi WES ha permesso di identificare mutazioni nei geni TP53, PIK3CA e CDKN2A in tutti i tumori primitivi, sia nei pazienti recidivanti che in quelli non recidivanti. Nella coorte recidivante, oltre il 90% dei pazienti mostrava la stessa mutazione del primitivo in uno o più linfonodi istologicamente negativi, spesso distribuiti a più livelli cervicali, con frequenze alleliche varianti (VAF) comprese tra 0,01% e 1,5%. Le stesse mutazioni sono state invariabilmente confermate nelle recidive, indipendentemente dall’intervallo tra diagnosi iniziale e ricomparsa clinica (7 mesi–10 anni), a dimostrazione della loro stabilità come driver clonali. Al contrario, i pazienti non recidivanti presentavano linfonodi prevalentemente negativi per le mutazioni del primitivo, in coerenza con la sopravvivenza libera da malattia a lungo termine (60–132 mesi); solo un caso ha mostrato positività sporadiche e a basse frequenze, non associate a recidiva. I linfonodi istologicamente positivi di 4 pazienti con OSCC avanzato, utilizzati come controlli, hanno confermato la presenza della mutazione del primitivo, con VAF proporzionali al contenuto di cellule tumorali. L’espressione dei miRNA è stata valutata nella stessa coorte, evidenziando una costante deregolazione di specifici trascritti nel tessuto tumorale rispetto alla mucosa normale istologicamente sana, anche se non sempre direttamente correlata allo stato mutazionale. Inoltre, i campioni di biopsia liquida di 3 pazienti con OSCC precoce recidivante hanno mostrato una clearance molecolare immediata dopo chirurgia, seguita da una ricomparsa precoce di malattia minima residua (MRD) e da un progressivo aumento del ctDNA, che ha preceduto la recidiva clinica. L’analisi dei mouthwash ha mostrato una maggiore sensibilità nel rilevare persistenze loco-regionali rispetto al plasma. L’espressione dei miRNA nella biopsia liquida ha confermato la fattibilità di rilevare piccoli RNA circolanti nel siero e nella saliva, sebbene le loro dinamiche non fossero sempre concordanti con il ctDNA, suggerendo che i miRNA possano fornire informazioni biologiche complementari piuttosto che segnali sovrapponibili. Conclusions: L’analisi molecolare dei linfonodi istologicamente negativi in pazienti con OSCC in stadio precoce rappresenta un forte predittore di recidiva. La digital PCR e la biopsia liquida emergono come strumenti complementari per rilevare la disseminazione occulta, le micrometastasi linfonodali e per monitorare l' MRD, con potenziale per affinare la stadiazione TNM e consentire una gestione personalizzata dei pazienti.