Titolo della tesi: Custom-Engineered Extracellular Vesicles to Counteract Muscle Degeneration
Razionale
Le distrofie muscolari sono miopatie degenerative ereditarie. Le forme più diffuse derivano da mutazioni nel gene della distrofina o in componenti del complesso proteico associato alla distrofina (DAPC) 1. Tra queste mutazioni quelle nel gene del β-sarcoglicano (βSGC), causano la distrofia muscolare dei cingoli di tipo 2E (LGMD2E), caratterizzata da disfunzioni muscolari scheletriche e cardiache ². Le comunicazioni intercellulari sono essenziali per l’omeostasi muscolare, e crescenti evidenze mostrano il coinvolgimento delle vescicole extracellulari (EVs) nei processi di rigenerazione muscolare ³. Tra i mediatori molecolari presenti nelle EVs vi sono i microRNAs (miRNAs, miRs), piccoli RNA non codificanti che svolgono diversi ruoli nella fisiopatologia del muscolo scheletrico 3. Recenti studi hanno dimostrato che trattamenti con EVs ingegnerizzate con specifici miRNA possono essere un buon strumento per contrastare la degenerazione muscolare 4.
Obiettivi del progetto
L’obiettivo di questo progetto è sviluppare EVs ingegnerizzate, arricchite con specifici microRNA pro-miogenici (miR-146b e miR-212), e valutare il loro ruolo funzionale nella rigenerazione muscolare e il loro potenziale terapeutico. Per questo scopo, EVs ingegnerizzate sono state testate su modelli cellulari umani e murini affetti da LGMD2E. Cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs) generate con CRISPR-Cas9 per l’abolizione dell’espressione del gene βSGC (βSGC-null hiPSCs), sono state utilizzate per mimare le caratteristiche della malattia in modelli muscolari in vitro 2D e 3D. Inoltre, l’efficacia delle EVs ingegnerizzate è stata valutata in topi C57BL/6 Sgcb-null.
Disegno sperimentale e metodi
Le cellule βSGC-null hiPSCs e il loro controllo sano isogenico sono state differenziate in miotubi (2D) e sferoidi muscolari (3D) utilizzando protocolli consolidati ⁵. Successivamente le EVs sono state isolate da cellule HEK293T DROSHA-null (quindi prive di miRNA endogeni) mediante ultracentrifugazione differenziale e caratterizzate tramite analisi del nanoparticle tracking analysis (NTA), microscopia elettronica a scansione (SEM) e ExoView per i marker delle EVs. Il caricamento dellle EVs con miR-146b e miR-212 è stato effettuato utilizzando il kit ExoFect™ (SBI), e confermato tramite RT-qPCR. I modelli muscolari in vitro (2D e 3D) sono stati trattati con EVs ingegnerizzate con il cocktail di miRNA o controlli scramble. Gli effetti sono stati valutati tramite immunofluorescenza, analisi morfologica ed espressione genica. In vivo, topi Sgcb-null hanno ricevuto iniezioni intramuscolari di EVs ingegnerizzate ogni cinque giorni per 30 giorni in concomitanza con il trattamento sono stati eseguiti test funzionali (grip strength, treadmill performance, gait analysis). Al termine del trattamento (giorno 30), i muscoli sono stati prelevati per le analisi istologiche.
Risultati
Entrambe le line di hiPSCs hanno differenziato con successo sia in 2D che in 3D. I miotubi βSGC-null 2D hanno mostrato un diametro maggiore e un numero di nuclei superiore rispetto ai controlli. Analogamente, gli sferoidi βSGC-null 3D hanno mostrato un numero di nuclei aumentato e un’area di sezione trasversale leggermente più ampia rispetto ai controlli. Tuttavia, tra le due linee cellulari, non sono state osservate differenze significative negli indici di differenziamento o fusione. Dopo essere state caratterizzate, le EVs sono state caricate con miR146b e miR212. In vitro, nei modelli sani, il trattamento con EVs ha aumentato il numero di nuclei per campo visivo, l’indice di differenziamento e quello di fusione, il numero e il diametro dei miotubi. Nei modelli βSGC-null, successivamente al trattamento sono risultati aumentati il numero di nuclei per campo visivo, l’indice di fusione e il numero dei nuclei; il diametro dei miotubi è risultato parzialmente normalizzato. In vivo, in topi Sgcb-null trattati con EVs caricate con i due miRs hanno mostrato un miglioramento della forza muscolare di presa e delle prestazioni funzionali misurate al treadmill dal giorno 15 di trattamento rispetto ai controlli (non trattato e trattato con vescicole caricare con scramble miRs).
Conclusioni
In conclusione, questo studio fornisce nuove evidenze sui meccanismi con cui i miRNA regolano la rigenerazione muscolare, dimostrando che la loro somministrazione mediata da EVs può migliorare il fenotipo patologico della LGMD2E in modelli murini e umani. Questi risultati suggeriscono che le EVs ingegnerizzate con miRNA pro-miogenici rappresentano una promettente strategia acellulare per la rigenerazione muscolare nelle distrofie muscolari.
Referenze
1) Gilbert G, et al. Front Cell Dev Biol. 2021, 9:737840. 2) Vainzof M, et al. Neuromuscul Disord. 2021, 31:1021-1027. 3) Yedigaryan L, Sampaolesi M. Cells. 2021,1, 10(11):3035. 4) Yedigaryan L, Sampaolesi M. Front Physiol. 2023, 14:1130063. 5) Caron L, et al. Stem Cells Transl Med. 2016, 5(9): 1145-61.