Titolo della tesi: BCL-2 INHIBITION AS A NEW THERAPEUTIC STRATEGY TO COUNTERACT MELANOMA PROGRESSION AND INCREASE PHARMACOLOGICAL RESPONSE
RAZIONALE: Il melanoma cutaneo metastatico rappresenta una delle forme più aggressive di cancro della pelle. Le principali strategie terapeutiche attualmente impiegate si basano sull’uso di inibitori della via delle MAP chinasi (MAPKi) e sugli inibitori dei checkpoint immunitari (ICI). Nonostante il loro successo in ambito clinico, l’insorgenza di resistenze, la risposta inadeguata ai trattamenti e l’assenza di terapie mirate per i pazienti con melanoma BRAF wild-type rappresentano una sfida significativa per ricercatori e clinici, rendendo necessarie ulteriori ricerche al fine di sviluppare nuove strategie terapeutiche in grado di aumentare la sopravvivenza dei pazienti affetti da melanoma metastatico. Le proteine anti-apoptotiche Bcl-2 e Bcl-xL svolgono un ruolo cruciale nella resistenza ai trattamenti oncologici e favoriscono la progressione tumorale orchestrando il cross-talk tra le cellule del melanoma e quelle del microambiente circostante. I BH3 mimetici, piccole molecole che hanno come bersaglio le proteine anti-apoptotiche appartenenti alla famiglia Bcl-2, rappresentano un approccio terapeutico promettente nel trattamento del cancro. In questo contesto, Venetoclax (ABT-199), il primo inibitore selettivo di Bcl-2, ha ottenuto l'approvazione della FDA per l’uso in diverse neoplasie ematologiche. Recentemente, abbiamo scoperto un nuovo mimetico pan-BH3, IS21, che ha dimostrato un'attività antitumorale preclinica in vitro e in vivo in molteplici tipi tumorali.
OBIETTIVI GENRALI: Gli obiettivi generali di questa tesi sono: (i) identificare nuovi ruoli pro-tumorali delle proteine anti-apoptotiche nel melanoma, in particolare nel favorire l’evasione immunitaria, e (ii) sviluppare nuovi approcci combinatori basati sull’inibizione delle proteine-anti-apoptotiche per migliorare il trattamento del melanoma metastatico.
DISEGNO SPERIMENTALE E METODI: In questo studio sono state utilizzate linee cellulari di melanoma sia stabilizzate che derivate da pazienti. L’efficacia antitumorale di un pannello di BH3 mimetici specifici [ABT-199 (Bcl-2), WEHI-539 (Bcl-xL), S63845 (Mcl-1)] e pan-specifici [ABT-263 (Bcl-2 e Bcl-xL), IS21 (Bcl-2, Bcl-xL e Mcl-1)], sia in monoterapia che in combinazione con inibitori della via MAPK (MAPKi), è stata valutata in vitro mediante saggi MTT, CellTiter-Glo, citofluorimetria a flusso e Western blot. Approcci genetici (siRNA, over-espressione) e farmacologici (BH3 mimetici) sono stati utilizzati per studiare la modulazione di PD-L1 da parte di Bcl-2 e Bcl-xL. Le analisi mediante citofluorimetria, Western blot, qRT-PCR e ChIP sono state impiegate per indagare il meccanismo molecolare responsabile della regolazione di PD-L1 mediata da Bcl-2. Modelli murini di xenotrapianto e allotrapianto sono stati utilizzati per valutare la capacità dei mimetici BH3 di potenziare l’efficacia della terapia a bersaglio molecolare (MAPKi) e degli inibitori dei checkpoint immunitario, rispettivamente.
RISULTATI: I nostri risultati hanno dimostrato che, in monoterapia, i mimetici BH3 riducono la vitalità cellulare e inducono apoptosi in un pannello di linee cellulari di melanoma, seppur con efficacia variabile, indipendentemente dallo stato mutazionale di BRAF. In regime combinatorio, ABT-199 e IS21 hanno mostrato un effetto sinergico nel potenziare l’efficacia della terapia a bersaglio molecolare sia nelle cellule BRAF wild-type in vitro, sia in quelle BRAF mutanti, sia in vitro ed in vivo. Successivamente, abbiamo identificato una correlazione positiva tra i livelli proteici di PD-L1 e Bcl-2, nelle linee cellulari di melanoma. Successivamente, abbiamo osservato che i livelli di espressione, la localizzazione in membrana e la secrezione di PD-L1 venivano ridotti in seguito al silenziamento di Bcl-2 mediante siRNA o ABT-199. A livello meccanicistico, è emerso che l’asse YAP/c-myc è coinvolto nella modulazione dei livelli di espressione di PD-L1 mediata da Bcl-2. Infine, studi in vivo hanno evidenziato una significativa riduzione della crescita tumorale e un aumento del tasso di sopravvivenza nei topi trattati con la combinazione di ABT-199 e ICI (anticorpo anti-PD1), rispetto a quelli trattati con i singoli agenti.
CONCLUSIONI: In conclusione, i nostri risultati hanno dimostrato che Bcl-2 regola l’espressione di PD-L1 nel melanoma e che i mimetici BH3 potenziano l’efficacia delle terapie a bersaglio molecolare e immunoterapiche.