Dottorato in TECNOLOGIE INNOVATIVE NELLE MALATTIE DELLO SCHELETRO,
DELLA CUTE E DEL DISTRETTO ORO-CRANIO-FACCIALE

Titolo della tesi: Studio di fattori trofici e neurotrofici nei tumori intracranici in età pediatrica

Introduzione: I tumori del sistema nervoso centrale (SNC) sono i secondi tumori più comuni che colpiscono i bambini e gli adolescenti dopo la leucemia. Circa la metà dei tumori infantili del SNC sono gliomi. La diagnosi istologica rappresenta il gold standard nell’ambito neuro-oncologico. Lo studio molecolare sul tessuto tumorale permette di caratterizzare i diversi oncotipi, consentendo di attivare le opportune strategie terapeutiche. Obiettivo: Lo scopo dello studio è stato quello di determinare l'espressione del TGF-β1 in relazione al VEGF e al suo recettore (VEGF-R) coinvolti nell’infiammazione e nell’angiogenesi dei tumori del SNC, insorti in soggetti di età pediatrica. Materiali e metodi: Presso il Dipartimento di Radiologia, Oncologia e Patologia dell’Università degli Studi di Roma "Sapienza", sono stati prelevati i campioni dai tessuti di 16 gliomi (9 maschi e 7 femmine, con età media pari a 8,4 anni) e 4 campioni di controllo (3 maschi e 1 femmina). I campioni di controllo non contenevano cellule tumorali visibili. I tessuti raccolti sono stati inclusi in paraffina. La diagnosi istopatologica dei 16 gliomi osservati è stata confermata in base al sistema di classificazione delle linee guida dell'OMS del 2016. L'analisi immunoistochimica è stata effettuata per valutare l'immunolocalizzazione di: TGF-β1, VEGF-A, VEGF-R1 e VEGF-R2 usando la tecnica ABC/HRP (avidina complessata con perossidasi biotinilata). L'estrazione di RNA da campioni fissati in formalina e inclusi in paraffina è stata eseguita con un kit (Thermofisher, Foster City, CA, USA). L'amplificazione del cDNA è stata eseguita utilizzando primer e sonde oligo etichettate con colorante reporter FAM (Life Technologies, Foster City, CA, USA). Al fine di accertare l'espressione di VEGF e VEGF-R2 nel compartimento delle cellule staminali tumorali, abbiamo eseguito un'analisi di citometria a flusso (FCM). L'analisi della FCM è stata eseguita su cellule in fase di crescita esponenziale, utilizzando tre popolazioni indipendenti. La percentuale di cellule positive al VEGF o al VEGF-R2 è stata definita rispetto al corrispondente controllo, utilizzando lo Substraction tool del software Summit v4.3 (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA). L'analisi statistica è stata eseguita mediante il test t di Student, utilizzando GraphPad Prism (La Jolla, CA). Un valore di p <0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Risultati: L'immunoreattività del VEGF è stata rilevata per mezzo della colorazione riscontrata nel citoplasma. I gliomi hanno mostrato principalmente un’immunocolorazione del VEGF, da moderata a forte, associata ad una maggiore espressione di molecole pro-infiammatorie nelle cellule di glioma, incluso il TGF-β1. La percentuale di cellule endoteliali positive al TGF-β1 era marcatamente più bassa nei vasi cerebrali normali rispetto ai vasi tumorali. L'immunocolorazione del TGF-β1 era localizzata nel citoplasma e nella superficie delle cellule. Nelle sezioni, VEGF-RII e TGF-β1 sono stati osservati in una porzione di cellule tumorali. Un'alta espressione di TGF-β1 ha mostrato una stretta correlazione con una marcata espressione di VEGF-R2 nelle cellule tumorali. L'immunocolorazione del VEGF-R1 era limitata al citoplasma delle cellule gliali. Nei gliomi cerebrali pediatrici rispetto ai campioni di controllo è stata rilevata una maggiore espressione dei seguenti geni: VEGFA, VEGFR1 e VEGFR2. In particolare, nei tessuti neoplastici l’espressione genica è risultata aumentata di circa sei volte per il VEGFA, nove per il VEGFR1 e undici per il VEGFR2, suggerendo un’attiva stimolazione della crescita del glioma e dell'angiogenesi. Conclusioni: I nostri dati hanno dimostrato che le cellule staminali del glioma, associate all'alta espressione di VEGF-A e TGF-β, svolgono un ruolo centrale nel promuovere la neovascolarizzazione del glioblastoma. Le relazioni tra le cellule staminali del glioblastoma e cellule endoteliali possono suggerire nuove opportunità terapeutiche per la strategia del trattamento antivascolare di queste neoplasie cerebrali.