Titolo della tesi: Development of in cells EPR protocols for a new service platform: spin labeled biological samples, interaction with metals and nanomaterials
La spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica (EPR) è una tecnica analitica versatile e potente utilizzata per la rilevazione diretta e la caratterizzazione di sistemi contenenti uno o più elettroni spaiati, definiti sistemi paramagnetici. Questi includono radicali liberi stabili e instabili, metalli di transizione paramagnetici e sistemi diamagnetici marcati con molecole chiamate spin labels. L'EPR è considerata la tecnica gold standard per lo studio dello stress ossidativo.
Negli ultimi decenni, la spettroscopia EPR di sistemi biologici complessi, in particolare delle proteine, si è sviluppata notevolmente, grazie alla possibilità di studiare la struttura, la dinamica e la funzione delle macromolecole biologiche e delle loro interazioni, in modo non distruttivo. Nonostante questi progressi, l'EPR viene ancora applicata principalmente a sistemi in soluzione, spesso a temperatura ambiente o criogenica e su campioni a concentrazione relativamente elevata. Queste condizioni si discostano da quelle degli organismi viventi. Questo gap limita la rilevanza della spettroscopia EPR negli studi dei fenomeni biologici reali. Lo scopo del lavoro è di colmare questo gap conducendo studi EPR in onda continua (CW-EPR) su diversi sistemi paramagnetici in ambienti cellulari.
Questo lavoro è stato sviluppato come parte di una più ampia iniziativa per lo sviluppo e la standardizzazione di metodologie avanzate di spettroscopia EPR all'interno della Core Facilities and Advanced Instrumentation Service (FAST) dell'Istituto Superiore di Sanità (ISS). Questo progetto mira a migliorare le capacità della piattaforma EPR, in particolare nel contesto della ricerca biologica e biomedica, e ad affermare l'EPR come tecnica complementare affidabile e accessibile per la comunità scientifica.
Sono stati studiati sei sistemi: sistemi paramagnetici endogeni (complessi rame-idrossitirosolo, ossido di grafene e i suoi ridotti) e sistemi diamagnetici marcati con spin labels convenzionali o innovativi, come proteine aggreganti (calcitonina di salmone e α-sinucleina umana), la proteina chaperon NarJ in interazione con il peptide NarG e le cellule CHO.
L'obiettivo centrale che unifica gli esperimenti presentati in questa tesi è l'uso della spettroscopia CW-EPR per studiare come i sistemi biologici - siano essi intrinsecamente paramagnetici o resi paramagnetici attraverso lo spin labeling - interagiscono con gli ambienti cellulari. Negli esperimenti sono stati studiati diversi materiali e molecole (piccole molecole, membrane, nanomateriali, proteine aggreganti e complessi proteico-peptidici), ma per tutti l'obiettivo comune è di adattare e ottimizzare metodologie EPR consolidate e innovative per applicazioni biologiche, in condizioni il più possibile simili a quelle cellulari.
La strategia adottata in ogni esperimento prevede una caratterizzazione iniziale dei sistemi a temperatura ambiente e criogenica, variando il pH e la concentrazione, se opportuno. Questa fase preliminare permette di analizzare il segnale EPR in condizioni controllate. Una volta caratterizzati, questi sistemi sono stati inseriti nelle cellule o, quando ciò non era possibile, è stata studiata l’interazione con le cellule, con l'obiettivo di indagare come il segnale EPR sia influenzato dall'ambiente cellulare.
I complessi idrossitirosolo-rame(II) sono stati studiati nelle cellule TNBC: lo studio ha dimostrato che l’idrossitirosolo (HDT) agisce come chelante del rame endogeno in cellula e questo è stato rilevato come un segnale proporzionale alla concentrazione di HDT.
Lo studio EPR delle membrane spin-labellate di cellule CHO, usato per esaminare gli effetti dell’acido NDA mostrano un’alterazione dipendente dal tempo nella fluidità di membrana.
Per l’ossido di grafene (GO) e i suoi ridotti (rGOs) l’EPR permette la rilevazione di difetti del carbonio e di impurezze metalliche, mentre gli studi dell’interazione con le cellule suggeriscono un’interazione con le membrane che non altera le proprietà globali di membrana.
Modelli di proteine aggreganti come la calcitonina di salmone (sCT) e un mutante (A56C) di α-sinucleina umana, marcate con spin labels comuni o innovativi, sono state studiate in interazione con le cellule neuronali HT22, e hanno fornito indicazioni sull’ aggregazione e sulla stabilità degli spin labels in ambienti riducenti.
Le interazioni proteina-peptide, usando una proteina chaperon NarJ e un suo interattore, il peptide NarG, inseriti in cellule E. coli e marcati con spin labels con 15N e 14N ha permesso di distinguere le due molecole in cellula anche se con risoluzione limitata a causa dell’allargamento di riga nell’ambiente cellulare.
I risultati confermano che la tecnica CW-EPR può fornire informazioni biofisiche e biochimiche rilevanti anche nelle difficili condizioni cellulari. Tuttavia, la principale limitazione identificata rimane la sensibilità relativamente bassa della CW-EPR in condizioni fisiologiche e a basse concentrazioni di analiti, che rende essenziale una rigorosa ottimizzazione per ogni specifico sistema.
Il progetto ha portato alla convalida di diversi protocolli di preparazione e di marcatura dei campioni e può contribuire al lavoro per integrare la spettroscopia EPR nella ricerca in life science. Questo lavoro ha fornito alla ISS EPR Facility protocolli e strumenti affidabili e convalidati, adatti a offrire un portfolio più ampio di analisi basate sulla spettroscopia EPR per supportare la ricerca sui meccanismi cellulari in condizioni fisiologiche e nel caso di malattie, come quelle neurodegenerative e tumorali. I protocolli vengono compilati e resi disponibili attraverso la piattaforma ISS per favorirne la riproducibilità e un’adozione più ampia.