Titolo della tesi: Sistema REPorter che rileva lo stress cellulare nei modelli di ORGanoidi trattati con le terapie ad RNA - Sistema REP-ORG. REPorter system for RNA-based therapy detecting cellular stress in ORGanoid models - REP-ORG systems.
Titolo: “Sistema REPorter che rileva lo stress cellulare nei modelli di ORGanoidi trattati con le terapie ad RNA - Sistema REP-ORG”
Introduzione:
La comprensione dei meccanismi regolatori dell’RNA ha portato allo sviluppo di terapie innovative capaci di modulare l’espressione genica alla base di diverse patologie. Nonostante il grande potenziale, queste strategie presentano ancora limitazioni legate alla molteplicità delle funzioni e alla malleabilità strutturale delle molecole di RNA. È quindi necessario sviluppare nuove metodologie per migliorarne sia la precisione della somministrazione sia l’efficacia terapeutica. Questo studio si inserisce in un progetto di ricerca volto a standardizzare un sistema per l’analisi della farmacodinamica dei farmaci a base di RNA, con particolare attenzione all’identificazione degli effetti off-target. In questo contesto, abbiamo generato modelli di organoidi reporter utili alla valutazione degli effetti a lungo termine su bersagli non specifici.
Metodi e Risultati:
Sono stati generati costrutti contenenti proteine fluorescenti, GFP e YFP, sotto il controllo di sequenze consenso riconosciute dai fattori trascrizionali coinvolti nella risposta infiammatoria (NF-kB) e nello stress ossidativo (Nrf2). Questi sono stati stabilizzati in linee cellulari derivate da diversi tessuti, tra cui muscolo (le linee C2C12 e C2SOD11), fegato (HepG2 e HUH7), tiroide (Nthy-ori, K1, BCPAP) e pancreas (MIA PaCa-2 e PANC-1). Il corretto funzionamento dei costrutti è stato convalidato in colture 2D trattate con perossido di idrogeno, analizzando l'attivazione di NF-kB e Nrf2 tramite Real-Time PCR e Western blot. Successivamente, le cellule trasfettate sono state coltivate utilizzando matrice extracellulare. Gli organoidi ottenuti sono stati trattati in modo cronico con il siRNA anti-RYR22, la molecola oggetto di studio nel progetto PNRR, che ha come bersaglio l'allele mutante del gene RYR2, causa della tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica (CPVT). Gli organoidi sono stati monitorati tramite microscopio a fluorescenza e la fluorescenza è stata quantificata con il Varioskan. Quando è comparsa la fluorescenza, indice dell’attivazione dei pathway di stress cellulare, abbiamo raccolto gli organoidi e analizzato, tramite Real-Time PCR, l'espressione di due geni, RUFY3 e RPGR, potenziali off-target identificati tramite l'analisi in silico della sequenza del siRYR2-U10.
Conclusioni:
Abbiamo sviluppato i sistemi REP-ORG per standardizzare l'analisi degli effetti avversi dei farmaci a RNA. Questo approccio consente di rilevare l'espressione genica aberrante e gli effetti off-target delle terapie a base di RNA, sfruttando l'attivazione della fluorescenza indotta dallo stress cellulare. Inoltre questi sistemi consentono di determinare la dose massima tollerata dei farmaci a RNA dalle cellule.
(1) Martini, M.; Dobrowolny, G.; Aucello, M.; Musarò, A. Postmitotic Expression of SOD1(G93A) Gene Affects the Identity of Myogenic Cells and Inhibits Myoblasts Differentiation. Mediators Inflamm 2015, 2015, 537853. DOI: 10.1155/2015/537853.
(2) Bongianino, R.; Denegri, M.; Mazzanti, A.; Lodola, F.; Vollero, A.; Boncompagni, S.; Fasciano, S.; Rizzo, G.; Mangione, D.; Barbaro, S.; et al. Allele-Specific Silencing of Mutant mRNA Rescues Ultrastructural and Arrhythmic Phenotype in Mice Carriers of the R4496C Mutation in the Ryanodine Receptor Gene (Circ Res 2017, 121 (5), 525-536. DOI: 10.1161/CIRCRESAHA.117.310882.