Dottorato in BIOLOGIA CELLULARE E DELLO SVILUPPO

Titolo della tesi: Analysis of the effect of long-term elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor therapy on immune cells of people with cystic fibrosis

Background: La fibrosi cistica (FC) è una malattia autosomica recessiva causata da mutazioni nel gene CFTR, che determinano un difetto nel trasporto di cloruro e bicarbonato, disidratazione delle vie aeree, infezioni croniche e infiammazione. Nel 2019, la tripla combinazione di modulatori CFTR elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (ETI) è stata approvata per il trattamento delle persone con FC portatrici di almeno una mutazione F508del, offrendo una terapia altamente efficace per il 90% dei pazienti. L’elevata efficacia clinica dell'ETI ha stimolato lo studio degli effetti della terapia su altri fattori determinanti nella progressione della malattia, come le infezioni batteriche delle vie aeree, l’infiammazione e le alterazioni della risposta immunitaria innata. Considerata l’importanza delle cellule immunitarie nella risposta antimicrobica e infiammatoria, e la carenza di dati sugli effetti a lungo termine della terapia con ETI su queste cellule, abbiamo studiato l’attività antimicrobica dei monociti isolati ex vivo da pazienti affetti da FC dopo 12 e fino a 48 mesi di terapia con ETI. Inoltre, abbiamo analizzato l’espressione del CFTR a livello di RNA e di proteina in PBMC e monociti prima e dopo la terapia, e confrontato la funzionalità del canale CFTR tra monociti di pazienti trattati con ETI e donatori sani. Infine, è stato valutato l’effetto dell'ETI sull’infiammazione sistemica. Metodi: L’attività antimicrobica dei monociti isolati ex vivo è stata valutata mediante citofluorimetria dopo infezione dei PBMC con il ceppo di Pseudomonas aeruginosa esprimente GFP (PAO1-GFP). L’espressione del CFTR a livello di RNA e proteina nei PBMC e nei monociti è stata analizzata mediante qRT-PCR e Western blot. La funzionalità del canale CFTR è stata valutata misurando l’efflusso di ioni utilizzando una sonda fluorescente sensibile al cloro (MQAE). Infine, i livelli sierici di IL-6, IL-8 e IL-1β sono stati determinati mediante ELISA. Risultati: La terapia con ETI determina miglioramenti a lungo termine della funzionalità polmonare, e di altri parametri clinici, oltre a una riduzione della percentuale di pazienti FC infetti da patogeni tipici della malattia dopo quattro anni di trattamento. Il trattamento con ETI ha mostrato che il recupero dell’attività fagocitica da parte dei monociti FC si mantiene nel tempo, raggiungendo livelli simili a quelli dei donatori sani. L’espressione della proteina CFTR è aumentata sia nei PBMC che nei monociti, raggiungendo livelli simili ai controlli sani nei PBMC ma non nei monociti. I livelli di mRNA del CFTR sono aumentati nei PBMC dopo 12–48 mesi di terapia con ETI, mentre sono rimasti invariati nei monociti, suggerendo una eterogeneità della risposta al trattamento tra i diversi sottotipi di cellule immunitarie. Sebbene l’attività del canale CFTR nei monociti rimanga inferiore rispetto a quella delle cellule dei donatori sani, essa correla positivamente con il miglioramento della funzionalità polmonare. La terapia con ETI ha ridotto significativamente i livelli sierici di IL-6 e IL-1β, mentre non si hanno variazioni dei livelli di IL-8. Conclusioni: La terapia a lungo termine con ETI conferisce miglioramenti dei parametri clinici e infiammatori oltre ad una riduzione delle infezioni batteriche polmonari dopo quattro anni di trattamento. La terapia migliora ulteriormente la fagocitosi di P. aeruginosa da parte dei monociti, raggiungendo livelli simili a quelli dei donatori sani, mentre l’espressione e l’attività del canale CFTR rimangono significativamente inferiori rispetto ai controlli. Ulteriori studi sono necessari per valutare l’effetto dell'ETI su altre funzioni antimicrobiche dei monociti e sull’infiammazione sistemica.