Dottorato in TECNOLOGIE INNOVATIVE NELLE MALATTIE DELLO SCHELETRO,
DELLA CUTE E DEL DISTRETTO ORO-CRANIO-FACCIALE

Titolo della tesi: Proteomic and lipidomic analysis of exosomes in patients with melanoma according to clinical-pathological features and stage of the malignancy.

Abstract Exosomes are cell-derived vesicles, which circulate freely in the human body through bodily fluids and are able to penetrate cell membranes to deliver their messages. The plasma of cancer patients contains exosomes produced by both malignant and normal cells and exosomes from malignant cells may substantially modify the course of a disease. In this study we investigated the lipidomic and proteomic component of the exosomes, isolated from plasma of melanoma and control patients. The exosomes have been evaluated through transmission (TEM), scanning (SEM) and immunoelectron microscopy and then analyzed for size distribution and concentration by the nanoparticle tracking system. Mass spectrometric analysis and computational MS data analysis have been performed for the proteomic analysis, while the lipidomic analysis (lipid extraction and gas chromatography-mass spectrometry) was performed for lipid studies. We found that in melanoma patients, exosomes were higher in number and smaller in size compared to healthy donors and these results were confirmed by TEM, SEM and immunoelectron microscopy. The amount of fatty acids was higher in melanoma exosomes than in control, specifically lauric, palmitic and stearic acids, with a high contribution of sphingomyelin, ceramide and satured and mono-satured fatty acids. The integral membrane protein 2B (ITM2B) has been identified in the stage 0-1 patients, as well as for the protein Palmitoyl-protein thioesterase 1 (PPT1), while insulin-like growth factor-binding protein 5 (IGFBP5) and Syntenin-1 have been identified uniquely in exosomes from the stage 2 patients. Finally the proteins CD14, PON1, PON3, APOA5 were increased in melanoma patients and more in the stage 2. According to our results it can be deduced that, the greater number of exosomes in melanoma patients, their reduced size, the greater number of saturated fatty acids present in their plasma membrane, giving them greater plasticity and mobility, allow to the exosomes the capacity to reach different anatomical sites. Furthermore, the expression of specific proteins in stage II melanomas can explain how paradoxically, some melanoma patients with stage II have worse overall survival than patients with stage III disease. In conclusion, peculiar characteristics in the proteomic and lipidomic composition of the exosomes could favor the distribution of the same in the tissues, creating the pre-metastatic niche and inducing the metastatic process; however at the same time they could also be a useful biomarker for the follow-up of melanoma patients, as well as an important target for therapeutic development in the field of this malignancy. Riassunto Gli esosomi sono vescicole prodotte dalle cellule, circolano liberamente nel corpo umano attraverso i fluidi corporei e sono in grado di penetrare le membrane cellulari per dettare i messaggi biochimici da codificare. Il plasma dei pazienti oncologici contiene esosomi prodotti sia da cellule maligne e cellule normali, e gli esosomi provenienti da cellule maligne possono modificare sostanzialmente il decorso di una patologia. In questo studio abbiamo valutato la componente lipidomica e proteomica degli esosomi, isolati dal plasma in pazienti con melanoma e confrontati con pazienti sani. Gli esosomi sono stati valutati attraverso la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), la microscopia elettronica a scansione (SEM) e l’ immuno-microscopia elettronica e quindi analizzati in base alla distribuzione, alle dimensioni ed alla concentrazione attraverso un sistema di tracciamento delle nanoparticelle (Nanosight). L'analisi spettrometrica di massa e l'analisi computazionale dei dati sono state eseguite per lo studio proteomico, mentre la lipidomica è stata eseguita attraverso l’analisi dei lipidi, analisi degli acidi grassi e analisi degli acidi grassi in gas cromatografia e spettrometria di massa (GC-MS). Abbiamo scoperto che nei pazienti affetti da melanoma, gli esosomi sono più elevati di numero e di dimensioni minori rispetto ai donatori sani. La loro morfologia è stata studiata in dettaglio tramite microscopia TEM, SEM e immuno-microscopia elettronica. La quantità di acidi grassi è più alta negli esosomi dei pazienti con melanoma rispetto a quelli dei controlli sani (in particolare l’acido palmitico e stearico) così come è stato evidenziato un alto contenuto di sfingomielina, ceramidi, acidi grassi saturi e mono-saturi. Per quanto riguarda la proteomica, la proteina della membrana integrale 2B (ITM2B) è stata isolata nei pazienti di stadio 0-I, così come la proteina Palmitoyl-proteina tioesterase 1 (PPT1), mentre la proteina legante del fattore di crescita insulino-simile 5 (IGFBP5) e Syntenin-1 sono state identificate in modo univoco solo negli esosomi dei pazienti di stadio II. Infine le proteine CD14, PON1, PON3, APOA5 sono maggiormente presenti in pazienti affetti da melanoma e soprattutto nello stadio II. Dai nostri risultati si può dedurre che, il maggior numero e le ridotte dimensioni degli esosomi nei pazienti con melanoma permettono agli esosomi di raggiungere diversi siti anatomici e di oltrepassarli grazie al maggior numero di acidi grassi saturi presenti nella membrana plasmatica, conferendo loro maggior plasticità e mobilità. Inoltre l’espressione di specifiche proteine nei melanomi stadio II, può spiegare come paradossalmente alcuni pazienti con malattia in stadio II hanno una sopravvivenza in generale peggiore rispetto ad altri pazienti con malattia in stadio III. In conclusione, caratteristiche peculiari nella composizione proteomica e lipidomica degli esosomi potrebbero favorire la distribuzione degli stessi nei tessuti, creare la nicchia pre-metastatica e indurre il processo di metastatizzazione, tuttavia allo stesso tempo potrebbero essere considerati anche un utile biomarker per il follow-up dei pazienti affetti da melanoma ed un target importante per lo sviluppo terapeutico nell’ambito di questa sempre più comune patologia.