Dottorato in BIOLOGIA UMANA E GENETICA MEDICA

Titolo della tesi: Analisi del panorama mutazionale nella mielofibrosi mediante Next-Generation Sequencing: validazione metodologica, eterogeneità mutazionale e differenze nei pathway molecolari nelle forme primarie e secondarie

La mielofibrosi (MF) è una neoplasia mieloproliferativa cronica Philadelphia-negativa (MPN-Ph-) caratterizzata da una marcata eterogeneità clinica e biologica. Sebbene le mutazioni canoniche driver canoniche dei geni JAK2, CALR e MPL rappresentino gli eventi molecolari fondatori della malattia, numerose evidenze indicano che mutazioni aggiuntive coinvolgenti pathway epigenetici, dell’RNA splicing, RAS pathway, regolatori della trascrizione e del ciclo cellulare/apoptosi; contribuiscano in modo sostanziale alla progressione clonale e al rischio di trasformazione leucemica. In questo contesto, il sequenziamento di nuova generazione (NGS) rappresenta uno strumento fondamentale per la caratterizzazione molecolare della malattia. Alla luce della crescente rilevanza clinica della caratterizzazione molecolare nelle MPN-Ph-, il presente studio si è proposto di definire il panorama genetico della MF mediante un approccio NGS mirato, esplorando le differenze nell'assetto molecolare tra i diversi sottotipi di malattia ossia MF in fase prefibrotica (pre-PMF), MF in fase fibrotica (overt-PMF) e MF secondarie a policitemia vera o trobocitemia essenziale (PV-SMF, TE-SMF); valutando inoltre il contributo della frequenza allelica delle varianti (VAF) e delle interazioni tra pathway biologici alla definizione della complessità genetico-molecolare della MF. Sono stati analizzati 328 pazienti affetti da mielofibrosi, suddivisi in pre-PMF (n=79), overt-PMF (n=119) e SMF (n=130). La validazione del pannello NGS ha dimostrato elevate performance analitiche in termini di accuratezza, sensibilità, specificità, ripetibilità e riproducibilità. Complessivamente sono state identificate 684 varianti genetiche, delle quali 547 classificate come patogenetiche o probabilmente patogenetiche. Le mutazioni aggiuntive più frequentemente osservate hanno coinvolto i geni ASXL1, TET2, SRSF2, U2AF1, DNMT3A ed EZH2. L’analisi comparativa ha evidenziato una maggiore complessità genomica nelle forme overt-PMF rispetto alle pre-PMF, mentre le forme SMF hanno mostrato caratteristiche molecolari intermedie. Le analisi di co-mutazione hanno identificato ASXL1 come principale hub molecolare della malattia, con associazioni significative con U2AF1, SRSF2, EZH2, NRAS e SETBP1. Inoltre, una maggiore frequenza allelica di ASXL1 è risultata associata a un incremento del numero complessivo di mutazioni, suggerendo una relazione tra burden allelico di ASXL1 e complessità genomica. Tra i risultati ancillari, è stato rivalutato il ruolo di alcune varianti non canoniche del gene MPL, è stata descritta una nuova variante patogenetica non canonica nel gene MPL e sono stati descritti una serie di casi portatori della variante germinale SH2B3/LNK p.E78K, ipotizzando il possibile contributo di questa variante alla predisposizione di neoplasie mieloproliferative. Nel complesso il nostro studio prospettico multicentrico, ha confermato che la mielofibrosi rappresenta una malattia geneticamente complessa, nella quale l’interazione tra mutazioni driver canoniche e aggiuntive contribuisce in modo determinante alla definizione del fenotipo clinico e della traiettoria evolutiva della malattia. L’integrazione dell’analisi NGS nella pratica clinica ha consentito una migliore stratificazione prognostica e una più accurata definizione delle strategie terapeutiche adattate al rischio nei pazienti con MF.