Dottorato in MEDICINA MOLECOLARE

Titolo della tesi: Targeting NADH homeostasis through GPD2 inhibition and metabolic stress induces tumor regression in colorectal cancer

Il carcinoma colorettale (CRC) rappresenta la seconda causa principale di mortalità oncologica a livello mondiale ed è caratterizzato da una marcata riprogrammazione metabolica volta a sostenere la crescita e la sopravvivenza tumorale. In tale contesto, la glicerolo-3-fosfato deidrogenasi mitocondriale (GPD2), enzima chiave dello shuttle del glicerofosfato, emerge come regolatore critico dell’equilibrio redox. Attraverso l’analisi di dataset pubblici e campioni tumorali provenienti da modelli murini di tumorigenesi intestinale, abbiamo dimostrato che GPD2 risulta sovraespresso sia a livello di mRNA che di proteina nel CRC rispetto alla mucosa normale. Per indagarne il ruolo funzionale, abbiamo impiegato il silenziamento genico mediato da lentivirus, che ha determinato una marcata riduzione della proliferazione e della vitalità in diverse linee cellulari di CRC. Tramite uno screening virtuale di una libreria interna di composti, abbiamo identificato un nuovo inibitore allosterico di GPD2, denominato G2i. L’inibizione farmacologica di GPD2 mediante G2i ha significativamente compromesso la crescita tumorale in vitro e in modelli murini di CRC. Dal punto di vista meccanicistico, G2i ha interferito con l’ossidazione mitocondriale del NADH, inducendo uno squilibrio redox, accumulo di glicerolo-3-fosfato (G3P), riduzione dei livelli di ATP e compromissione della respirazione mitocondriale. Tali effetti sono risultati reversibili mediante il ripristino della capacità ossidativa del NADH tramite espressione di LbNOX, supplementazione di piruvato o induzione di LOX-CAT, confermando che l’accumulo di NADH e il collasso redox costituiscono le principali vulnerabilità indotte dal blocco di GPD2. In linea con il flusso elettronico alterato e l’aumentato squilibrio redox, l’inibizione di GPD2 ha determinato un incremento dei livelli di ROS e una rimodulazione del metabolismo lipidico. In particolare, G2i ha promosso la ferroptosi attraverso la produzione di ROS mediata dal redox e la modulazione del metabolismo lipidico. Considerato il ruolo della lattato deidrogenasi (LDH) come via compensatoria citosolica per il NADH, abbiamo valutato l’impatto della doppia inibizione di GPD2 e LDH sulla tumorigenesi del CRC. Il co-targeting di LDH e GPD2 ha amplificato lo stress redox, ridotto la rigenerazione di NAD⁺ e soppresso significativamente la crescita tumorale sia in vitro che in vivo, potenziando l’induzione della ferroptosi mediata da G2i. Per aumentare ulteriormente la vulnerabilità metabolica, abbiamo implementato protocolli di digiuno intermittente (IF), che limitano la disponibilità di substrati glicolitici. L’IF ha potenziato gli effetti antitumorali di G2i amplificando l’accumulo di NADH e il collasso energetico, conducendo a una soppressione tumorale accentuata tramite morte cellulare ferroptotica. Nel complesso, i nostri risultati identificano GPD2 come nodo farmacologicamente aggredibile nel metabolismo redox del CRC. La sua inibizione induce uno stress redox sintetico che compromette la funzione mitocondriale e la vitalità tumorale. Tale vulnerabilità può essere sfruttata mediante il co-targeting di vie compensatorie per il NADH o strategie di restrizione nutrizionale, delineando un quadro terapeutico basato sul disequilibrio redox e aprendo nuove prospettive per interventi metabolici nel CRC.