Dottorato in PLASTICITÀ NEUROSENSORIALE

Titolo della tesi: Sviluppo e validazione di un profilo metabolomico volto ad affiancare/sostituire le valutazioni strumentali dell’efficacia dell’esercizio fisico aerobico controllato in soggetti con diabete e neuropatia periferica

INTRODUZIONE. Il diabete mellito (DM) è uno dei più comuni disordini di origine endocrina che coinvolge circa 170 milioni di individui nel mondo. In particolare, il diabete mellito di tipo II (DMT2) è caratterizzato da una inadeguata risposta dei tessuti target alla secrezione di insulina da parte delle cellule Beta del Pancreas (insulino resistenza) e/o un’alterata secrezione dell’insulina stessa. La neuropatia periferica diabetica (NPD) sensitivo motoria è una complicanza presente in circa il 36% di tutta la popolazione diabetica italiana. La NPD ha una causa o concausa vascolare (microangiopatie dei vasa nervorum) che è dimostrato essere scatenata da vari meccanismi biochimici aventi come caratteristica comune l’eccesso di glucosio che determinano a carico del sistema vascolare danni aterogenici e modificazioni della parete vasale con conseguente coinvolgimento neurale. Nel controllo della iperglicemia, e conseguenzialmente nel contenimento dell’espressione infiammatoria, il ruolo dell’attività fisica nei pazienti DMT2 è cruciale. Nel DMT2, la debolezza muscolare dovuta ai processi vasculo-neuro degenerativi, coinvolge sia gli arti inferiori che in maniera minore quelli superiori ed è solo parzialmente correlata alla compromissione dei nervi motori dipendendo dalla velocità di contrazione muscolare e quindi l’esercizio può contrastare le alterazioni indotte dal diabete relativamente alla contrattilità della fibra muscolare. Nei pazienti con neuropatia, un esercizio aerobico controllato, sembra avere buoni risultati sul controllo del dolore e sul mantenimento dei parametri di monitoraggio del diabete. DISEGNO DELLO STUDIO La tipologia di ricerca proposta rientra nei criteri statistici dello studio caso controllo randomizzato. Sono stati arruolati pazienti sedentari DMT2 (da almeno un anno) con NPD e divisi in due gruppi randomizzati: un primo gruppo, denominato “SUPERVISIONATO” (INT=44) che ha ricevuto cure standard, monitoraggio ed addestramento teorico e pratico per svolgere attività fisica aerobica controllata, ed un secondo gruppo denominato “NON SUPERVISIONATO” (CTR=41 pazienti) che è stato seguito esclusivamente con monitoraggio e cure standard. La sedentarietà dei pazienti è stata considerata rispetto ad un’attività aerobica inferiore ai 150 minuti. Si è proceduto alla valutazione dell’attività neuro-muscolare mediante la rilevazione dei parametri analizzati con accelerometri potenziometrici, ECG ed eventualmente elettromiografia sulla base di protocolli validati con precedenti studi sul monitoraggio dell’attività fisica in soggetti diabetici. Ai soggetti arruolati, in occasione del monitoraggio strumentale, è stato praticato un prelievo ematico (un prelievo basale; uno dopo 3 mesi, ed uno dopo 6 mesi dall’inizio del monitoraggio). Le molecole analizzate per lo studio sono state: Stress ossidativo (d-ROMs e Bap-test), Insulina, Glucosio, Emoglobina glicosilata HbA1c, Colesterolo totale, Colesterolo-LDL, Colesterolo-HDL, Trigliceridi, Proteina C reattiva CRP, Transaminasi, Gamma-glutamil transferasi, Triptofano e Chinurenine. Inoltre per ogni paziente sono stati valutati, ad ogni incontro, i seguenti parametri: forza muscolare, controllo attività fisica e VO2MAX. OBIETTIVI Obiettivo primario di questo studio, è stato quello di creare un modello bio-metabolico utilizzando una rete neurale, per i pazienti con DMT2 e NPD, che rispecchiasse l’andamento delle misurazioni strumentali neuro-muscolari rispetto al miglioramento della neuropatia, a distanza di un lasso temporale congruo con la visita medica e le misurazioni inizialmente eseguite. Obiettivi secondari: Verificare, per ogni gruppo, se si sono registrate differenze sostanziali nel tempo, in termini di recupero muscolare/vascolare e valutare i livelli degli analiti esaminati per monitorare lo stress ossidativo ed infiammatorio. ANALISI STATISTICA DEI DATI Per le proporzioni è stato applicato il test di Fisher o del Chi square. Le differenze tra i due gruppi sono state valutate con t-test (unpaired) o Mann-Whitney test. Le variazioni nel tempo sono state monitorate con Anova Test per variabili con distribuzione parametrica oppure Friedman test per variabili distribuite in modo non parametrico. Per predirre la risposta rispetto ad un evento, sono state utilizzate le Receiver Operating Characteristic (ROC). L’analisi di regressione multipla (con metodo backward) è stata applicata impiegando come variabile dipendente il Miglioramento della neuropatia a sei mesi e come covariate tutte le variabili risultate significative all’analisi univariata (saranno verificate ed eliminate tutte le possibili colinearità). È stata inoltre implementata una rete neurale opportunamente addestrata per creare un modello che permettesse, misurando ad un predefinito tempo (T0) dei determinati analiti, di fornire informazioni circa la predittività rispetto al miglioramento o meno della neuropatia a sei mesi e porre quindi delle azioni correttive. Per la rete neurale sono state utilizzate le librerie NeuralNetTools, Neuralnet, Keras, Tensorflow e Nnet in R cran. Per le curve ROC il pacchetto impiegato è stato pROC. Il livello di significatività è stato fissato con p=0.05 e tutte le elaborazioni statistiche sono state condotte con il software R version 3.4.0 (2017-04-21) Copyright (C) 2017 The R Foundation. RISULTATI Dall’analisi dei dati, utilizzando l’approccio statistico classico, è emerso che lo stress ossidativo ed in particolare il d-Roms test ha subito una notevole riduzione al tempo T3 e T6 nei pazienti del gruppo INT rispetto al gruppo CTR (p=0.002; p<0.0001). Dall’analisi delle curve ROC, nel gruppo INT la predittività rispetto al miglioramento della neuropatia a 6 mesi, è risultata statisticamente più significativa per il gruppo INT considerando le variabili: Emoglobina glicosilata T0 (AUC=0.697); Emoglobina glicosilata T3 (AUC=0.625); Chinurenine/Triptofano T3(AUC=0.719); Forza muscolare gambe T0 (AUC=0.714). Per disegnare la rete neurale abbiamo creato un database per l’addestramento della rete (ReteAddestramento) ed un database di test (ReteTest). La neuropatia presente sia nel gruppo CTR che in quello INT, riguardava principalmente gli arti inferiori (rispettivamente 78.00% ed 81.81%) ed in minima parte quelli superiori. In entrambi i database, abbiamo inserito le variabili: Età, ALT, AST, BAP-test, BMI, Chinurenine, C-peptide, Pressione diastolica, d-Roms test, Attività fisica sedentaria, Massa grassa, Sesso, GGT, Gruppo, Emoglobina glicosilata; Colesterolo HDL; Altezza; Proteina-C reattiva, Insulina, Chinurenine/Triptofano; Colesterolo LDL, Attività fisica leggera h/die, Forza muscolare gambe, Attività fisica leggera Mets*h*set, Attività fisica moderata, Mets*h*set, Neuropatia arti inferiori, Attività. fis. generica, Mets*h*set, Attività sedentaria rilevata, Creatinina, Durata del sonno, Pressione sistolica, Colesterolo totale, Trigliceridi, Triptofano, Forza muscolare braccia, VO2max, Girovita e Peso. Il database di addestramento era composto da tutte le variabili elencate per entrambi i gruppi e rispetto ai tre tempi di monitoraggio che sono stati rispettivamente T0 (prima visita), T3 (visita a 3 mesi) e T6 (visita a 6 mesi). Il database di test era un file contenete le medesime variabili di 15 soggetti monitorati nell’ultimo anno ma che non sono stati inseriti nello studio mancando alcuni dati non ancora analizzati (parametri al tempo T3 oppure al tempo T6). La variabile di output della rete era rappresentata dal Miglioramento della neuropatia a sei mesi. Il modello ottenuto era formato da due strati hidden, il primo composto da 20 elementi, il secondo da 4 (dati modello: Errore=1.550696e-02; threshold= 8.485689e-03; Speps=1.362000e+03). La rete ha classificato correttamente tutti i soggetti eccetto uno. CONCLUSIONI La rete disegnata ed addestrata ha classificato correttamente un gruppo di soggetti test, e quindi possiamo asserire che il modello sviluppato, nonostante i limiti rappresentati dell’esigua numerosità campionaria, è idoneo allo scopo preposto. Dall’analisi della statistica di base, abbiamo inoltre dimostrato come esiste una riduzione dello stress ossidativo nei pazienti che eseguono attività aerobica controllata e come i parametri biochimici di base legati alla funzionalità epatica, subiscano degli abbattimenti significativi, a dimostrazione del fatto che l’esercizio fisico svolga un ruolo cruciale nella gestione delle disregolazioni neuropatiche. In particolare, il miglioramento della NPD a sei mesi, potrebbe essere funzione di una immunotolleranza maggiore indotta dall’attivazione del pathway delle Chinurenine/Triptofano. Un ampliamento dello studio con una maggiore numerosità campionaria, potrà fornire risultati che confermeranno il lavoro preliminare svolto.