Titolo della tesi: Intracellular pathways involved in exosome biogenesis: a study of their roles and mechanisms
Razionale/background
Gli esosomi sono small extracellular vesicles che si formano per invaginazione della membrana dei compartimenti endosomiali tardivi/corpi multivescicolari (MVB). Essi rivestono un ruolo cruciale nella comunicazione intercellulare, sia in condizioni fisiologiche che patologiche, trasferendo proteine, metaboliti e acidi nucleici alle cellule riceventi. La composizione degli esosomi è determinata dal tipo di cellula da cui hanno origine e dai pathway intracellulari coinvolti nella loro biogenesi e nel rilascio nello spazio extracellulare. Diversi componenti cellulari sono state implicate nella regolazione della biogenesi degli esosomi, tra cui il complesso ESCRT, il pathway sintenina–alix, le tetraspanine e lipidi, come la ceramide. Tuttavia, molti aspetti relativi a questi processi non sono ancora stati completamente chiariti.
Obiettivi generali
Nel nostro laboratorio abbiamo sviluppato una metodologia per ottenere esosomi fluorescenti (Bodipy exo), di origine endosomiale, utilizzando Bodipy FL C16, un acido palmitico fluorescente. Una volta internalizzato dalle cellule, il C16 viene convertito in fosfolipidi che si vengono incorporati nel doppio strato lipidico delle vescicole secrete. I Bodipy exo possono essere quantificati con precisione tramite citometria a flusso (FC) e successivamente caratterizzati. L’obiettivo di questo progetto è approfondire i meccanismi coinvolti nella biogenesi degli esosomi, combinando questa tecnica di marcatura con l’uso di un panel di inibitori noti di vie intracellulari, andando a valutare la secrezione e la caratterizzazione degli esosomi fluorescenti.
Design sperimentale e metodi
Gli esosomi fluorescenti secreti da cellule di melanoma incubate con BODIPY FL C16 e trattate con inibitori di pathway intracellulari sono stati isolati tramite ultracentrifugazioni differenziali e quantificati mediante citometria a flusso e Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). La colocalizzazione dei Bodipy exo con anticorpi fluorescenti anti-tetraspanine è stata determinata tramite FC. La caratterizzazione del contenuto proteico delle sEV è stata eseguita tramite Western Blot. È stata inoltre condotta un’analisi al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) delle cellule trattate con gli inibitori.
Risultatimediante citofluorimetria sono state osservate differenze significative nella secrezione di Bodipy exo, in seguito al trattamento delle cellule di melanoma con specifici inibitori di pathway intracellulari. Sono stati valutati composti che agiscono sul metabolismo del colesterolo e dell’acido lisobisfosfatidico (LBPA), sulla sintesi della ceramide, sull’acidificazione endolisosomiale e sul traffico intracellulare. L’aumento più marcato nella secrezione di esosomi fluorescenti è stato osservato in seguito al trattamento con U18666A, al contrario di quanto accade con la Thioperamide, suggerendo che il colesterolo, e non l'LBPA, sia il principale responsabile di tale effetto. Gli inibitori del metabolismo della ceramide, GW4869 e Desipramina, che agiscono rispettivamente sulle sfingomielinasi neutra e acida, hanno mostrato effetti opposti, evidenziando ruoli distinti delle isoforme di sfingomielinasi nella regolazione della secrezione degli esosomi. In particolare, GW4869 ha ridotto selettivamente la secrezione di Bodipy exo senza influenzare il rilascio delle sEV totali. Gli inibitori dell’acidificazione endolisosomiale hanno prodotto effetti diversi: la Bafilomicina A1, un inibitore della V-ATPasi, ha aumentato la secrezione di Bodipy exo, mentre la Monensina, che agisce tramite un meccanismo diverso, non ha avuto effetto, supportando un ruolo specifico della V-ATPasi nella biogenesi degli esosomi. Nella maggior parte delle condizioni, la percentuale di Bodipy exo positivi per le tetraspanine (CD63, CD81, CD9) è rimasta stabile, suggerendo un effetto minimo sul loro sorting delle tetraspanine. Tuttavia, l’analisi tramite Western Blot ha rivelato notevoli differenze nella composizione proteica delle sEV, anche in assenza di variazioni nella quantità di vescicole secrete, indicando che gli inibitori possono influenzare selettivamente il sorting del cargo proteico. Infine, l’analisi TEM ha mostrato variazioni significative nel numero di corpi multivescicolari (MVB) e vescicole intraluminali (ILV), riflettendo cambiamenti strutturali correlati alla modulazione dei pathway intracellulari coinvolti nella biogenesi degli esosomi.
Conclusioni
L’uso di specifici inibitori di pathway intracellulari influenza non solo la secrezione delle sEV, ma anche la loro composizione proteica. Questi risultati suggeriscono che alterazioni nei pathway del traffico intracellulare possono influenzare il sorting delle proteine, modulando pertanto il processo di biogenesi degli esosomi. In conclusione, questo approccio sperimentale fornisce informazioni sui meccanismi molecolari alla base della formazione degli esosomi e costituisce una base per ulteriori studi sui pathway regolatori coinvolti.