Titolo della tesi: Study of new diagnostic markers in protein misfolding diseases
Le malattie neurodegenerative causate dal misfolding proteico, come le prionopatie e le sinucleinopatie, mancano ancora di biomarcatori diagnostici affidabili e minimamente invasivi. Le Seed Amplification Assays (SAA) — una classe di tecniche ultrasensibili che sfruttano la natura auto-propagante degli aggregati proteici mal ripiegati per amplificare e rilevare quantità minime di semi patologici — sono emerse come strumenti potenti per l’identificazione di aggregati proteici specifici di malattia in campioni biologici facilmente accessibili. Tra queste, la Real-Time Quaking-Induced Conversion (RT-QuIC) si è dimostrata una delle metodiche più robuste e riproducibili. La RT-QuIC si basa sul principio secondo cui i semi proteici patologici possono indurre la conversione conformazionale di proteine ricombinanti normali in aggregati mal ripiegati, la cui formazione è stimolata da cicli di agitazione vigorosa e temperature elevate e monitorata in tempo reale attraverso un segnale di fluorescenza. Questa ricerca di dottorato ha avuto l’obiettivo di ottimizzare le condizioni di RT-QuIC per l’applicazione in biofluidi periferici, in particolare saliva e fluido lacrimale, al fine di valutarne la fattibilità, la robustezza analitica e il potenziale diagnostico nella malattia di Creutzfeldt–Jakob (CJD) e nella malattia di Parkinson (PD). È stata prestata particolare attenzione alle variabili pre-analitiche relative alla gestione e preparazione dei campioni, come i cicli di congelamento-scongelamento, le condizioni di conservazione, la sonicazione e i protocolli di campionamento, che si sono rivelate determinanti per la riproducibilità del saggio. Inoltre, la scelta del substrato proteico ricombinante si è dimostrata cruciale, con differenti prestazioni osservate tra proteine prioniche di diverse specie animali e l’α-sinucleina (α-syn) commerciale standardizzata, che ha mostrato una migliore riproducibilità inter-laboratorio rispetto alle preparazioni interne.
I saggi ottimizzati hanno dimostrato che la RT-QuIC eseguita su saliva e fluido lacrimale è in grado di discriminare i pazienti con CJD e PD dai controlli. Inoltre, per la CJD, dove erano disponibili campioni abbinati di liquido cerebrospinale (CSF), i risultati della RT-QuIC ottenuti da saliva e fluido lacrimale sono stati confrontati con quelli del CSF, rivelando una sensibilità inferiore nei fluidi periferici, ma un pattern diagnostico coerente. Tale confronto non è stato effettuato per la PD, a causa della mancanza di campioni di CSF corrispondenti. Nonostante queste limitazioni, saliva e fluido lacrimale offrono chiari vantaggi in termini di non invasività e idoneità al monitoraggio longitudinale. Questi risultati confermano saliva e fluido lacrimale come matrici alternative promettenti per il rilevamento, tramite RT-QuIC, delle forme patologiche della proteina prionica (PrPSc) e dei semi di α-sin, e sottolineano la necessità di armonizzare i protocolli, adattare quantitativamente i metodi e integrarli con biomarcatori complementari come la neurofilament light chain (NfL), la glial fibrillary acidic protein (GFAP) e le tecniche di imaging avanzate.
In conclusione, questo lavoro contribuisce allo sviluppo di strumenti diagnostici minimamente invasivi, standardizzati e clinicamente rilevanti, ponendo le basi per future applicazioni nella diagnosi precoce, nella stratificazione dei pazienti e nel monitoraggio terapeutico delle malattie da misfolding proteico.