Dottorato in MEDICINA MOLECOLARE

Titolo della tesi: LC-MS/MS method development and analysis of steroid hormones in different biological matrices

L'obiettivo principale del mio progetto di dottorato è lo sviluppo di metodi analitici in grado di identificare i modelli endocrini steroidogenici in diverse matrici biologiche. Nello specifico, ho studiato un metodo LC-MS per identificare e quantizzare i principali ormoni steroidei in diversi ambienti. L'obiettivo era identificare il modello steroideo specifico nei topi a cui era stata indotta la PCOS e ulteriormente trattata con mio-inositolo. Tuttavia, data la mancanza di valori di riferimento per gli ormoni steroidei sierici nei topi, siamo stati costretti a verificare in precedenza come i livelli ormonali potessero fluttuare in una popolazione normale. Pertanto, abbiamo esteso le misurazioni analitiche a topi sani senza PCOS. I dati ottenuti verranno utilizzati per creare un archivio di dati di riferimento e per fornire un punto di partenza migliore per successivi studi endocrini. Tali studi sono in corso, ma i risultati preliminari finora raccolti confermano la validità del metodo LC-MS. Contemporaneamente, abbiamo pianificato di accertare la produzione di steroidi ottenuta direttamente da colture di cellule della teca e della granulosa. Abbiamo quindi deciso di includere un altro gruppo sperimentale, composto da cellule ovariche bovine. Topo e bovino sono due modelli animali di riferimento per studiare il sistema riproduttivo ed endocrino. Per confermare la validità del metodo LC-MS e del protocollo di estrazione delle matrici ho deciso di testare il siero umano di donne e uomini in età fertile. Infatti, in questo caso, la concentrazione di ormoni steroidei è più alta che nei topi. La valutazione LC-MS degli ormoni steroidei presenta diverse criticità, una delle quali è che le somiglianze strutturali spiegano che il riconoscimento del segnale può sovrapporsi tra due molecole simili. Per superare questo problema sono stati scelti due metodi cromatografici distinti, uno per testosterone, androstenedione, DHEA, DHT e progesterone e uno per estrone e 17β-estradiolo, utilizzando la stessa fase mobile e polarità dello strumento ma con due colonne cromatografiche diverse. La migliore fase mobile è risultata essere H2O: MeOH + formiato di ammonio allo 0,1% mentre le due colonne cromatografiche hanno due diverse fasi stazionarie, Phnyl Bridge e C18, rispettivamente per estrogeni e altri analiti. Le due prove cromatografiche hanno una durata di 7 minuti ciascuna e il gradiente di flusso è stato il seguente: MeOH 50% da 0 a 0,5 min., fino al 75% da 1 a 5 min e alla fine 98% da 5,5 a 7 min per l'euforia degli estrogeni. L'altro gradiente di flusso era il seguente: MeOH 70% da 0 a 4 minuti, poi fino al 98% a 7 minuti. La portata è di 0,3 ml/min e la temperatura del forno è di 40°C. La valutazione del metodo di estrazione è determinata dalla quantità di campione da estrarre. È stato implementato un protocollo per il terreno di coltura per concentrare il campione. Utilizziamo precolonne C18 per concentrare l'elevata quantità di supernatante della coltura cellulare. A causa della minore quantità di topi e siero umano, il protocollo raccomanda l'estrazione liquido-liquido utilizzando una miscela di esano: acetato di etile 9:1.