Dottorato in MALATTIE INFETTIVE, MICROBIOLOGIA E SANITA' PUBBLICA

Titolo della tesi: STUDIO DELLA TOSSICITÀ INDOTTA DA NANDROLONE SULL’ENCEFALO IN UN MODELLO ANIMALE (TOPI).

Introduzione: L'uso degli steroidi androgeni anabolizzanti (AAS) è molto diffuso grazie alla loro capacità di migliorare la crescita muscolare a fini estetici e le prestazioni degli atleti, riducendo al minimo gli effetti androgenici. Tuttavia, gli AAS hanno effetti collaterali, che coinvolgono tutti gli organi, i tessuti e le funzioni corporee, in particolare la tossicità a lungo termine che coinvolge il sistema cardiovascolare e il sistema nervoso centrale, per tale motivo, quindi il loro abuso è considerato un problema di salute pubblica. Scopo del progetto è dimostrare gli effetti morfologici dell'uso prolungato di AAS in un modello animale di topo, concentrandosi sul meccanismo apoptotico e sulle aree cerebrali coinvolte negli effetti comportamentali, la memoria e gli aspetti emozionali. Materiali e metodi: Il presente studio è stato condotto su 24 topi sani di sesso maschile e divisi in 4 gruppi da 6. Gli esperimenti sono stati condotti secondo linee guida e protocolli nazionali, approvati dall'Institutional Animal Ethics Committee (IAEC n.03/028/07). Il primo gruppo (G1) di 6 topi è stato allenato (tapis roulant) con una dose di nandrolone decanoato pari a 1,875 mg/kg; al secondo gruppo di 6 topi sedentari è stata somministrata una dose di nandrolone decanoato pari a 1,875 mg/kg; il terzo gruppo (G3) di 6 topi allenati, è stato trattato con un veicolo; il quarto gruppo (G4) di 6 topi sedentari è stato trattato con veicolo. Successivamente gli animali sono stati sacrificati, sono stati prelevati campioni di encefalo da ciascun topo per l'analisi istologica, focalizzando l'attenzione sulla corteccia frontale e sull'ippocampo. Per l’esame istologico è stata utilizzata la colorazione con emetossilina ed eosina; per l'immunorerazione, l'anticorpo caspasi 3. Anche l'espressione della colorazione dell'anticorpo caspasi-3 è stata riconosciuta come negativa o positiva. Lo scolorimento definito dall'immunoistochimica era distinto così come il riconoscimento del cromogeno bruno all'interno del citoplasma e/o del nucleo. L’analisi statistica è stata effettuata usando GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). È stato utilizzato un t-test non appaiato e valori di P inferiori a 0.05 (P <0.05) sono stati considerati statisticamente significativi. Risultati: l’esame istologico con ematossilina e eosina in tutte le regioni dell’ippocampo dei topi trattati con nandrolone (gruppi G1 e G2) (fig. 10 e 11) ha evidenziato neuroni morfologicamente degenerati che assumono una forma cellulare schiacciata e sono caratterizzati da ipercromia del nucleo. Contrariamente, tutte le regioni dell’ippocampo dei topi non trattati con nandrolone (gruppi G3 e G4) (fig. 12 e 13) sono caratterizzate da una normale morfologia dei neuroni e da una colorazione più chiara dei nuclei. Anche nel lobo frontale è evidente una differenza tra i gruppi G1, G2 e i gruppi G3, G4. In particolare, le cellule neuronali delle sezioni di lobo frontale dei gruppi G1 e G2 sono caratterizzate da un restringimento della dimensione. Tale caratteristica morfologica è particolarmente evidente nel gruppo G1 (figura 14). Viceversa, nei gruppi G3, G4 questa variazione morfologica non è presente. L’indagine immunoistochimica con anti-Caspasi-3 delle sezioni di ippocampo ha mostrato una intensa e diffusa immunopositività dei nuclei delle cellule neuronali nel gruppo G1 e una intensa immunopositività nel gruppo G2. I gruppi G3, G4 hanno invece mostrato esito negativo alla reazione immunoistochimica (figura 15). Non sono state osservate differenze di positività significative tra i gruppi sottoposti ad allenamento e quelli allenati. Conclusioni: nei topi trattati in maniera prolungata con ND, i campioni di encefalo sia in corrispondenza dell’ippocampo che della corteccia frontale mostravano la morfologia dei neuroni degenerati caratterizzata da nuclei scuri, citoplasma eosinofilo e restringimento delle cellule. E’ stata inoltre dimostrata morfologicamente un ‘attivazione del fenomeno apoptotico, in particolare della via intrinseca dell’apoptosi. Lo studio immunoistochimico mediante l’utilizzo dell’immunoreazione con l’anticaspasi 3 ha mostrato una diffusa positività ippocampale nel caso di esposizione a ND, statisticamente significativa, rispetto ai gruppi di controllo. Tuttavia, dal punto di vista morfologico non sono state osservate differenze statisticamente significative tra i gruppi sottoposti ad allenamento e quelli sedentari. Tale dato morfologico conferma il ruolo degli AAS nel determinismo di un processo neurodegenerativo e pertanto di effetti comportamentali e funzionali coinvolgenti il sistema nervoso. L’apoptosi e lo stress ossidativo sono coinvolti nel danno encefalico e nella neurodegenerazione, in particolare nella regione frontale e nell’ippocampo, pertanto, nelle sequele a lungo termine dell’abuso di AAS. La caspasi 3, essendo una caspasi esecutrice, è un marker affidabile per il danno d’organo e l’attivazione del processo apoptotico a livello encefalico.