Titolo della tesi: Development of an efficient lipid nanoparticle-based gene delivery system for the treatment of Duchenne Muscular Dystrophy
La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una patologia genetica legata al cromosoma X causata da diverse mutazioni nel gene della distrofina, che determinano una grave degenerazione muscolare e insufficienza respiratoria. Negli ultimi decenni sono stati compiuti importanti progressi nello sviluppo di strategie di terapia genica; tuttavia, il successo di tali approcci è stato limitato dalle grandi dimensioni del gene DMD. Per superare questo ostacolo, recenti studi hanno portato alla progettazione di micro-distrofine (μDys) ingegnerizzate, versioni ridotte del gene della distrofina che escludono domini funzionali non essenziali. Nonostante ciò, garantire una consegna efficiente e mirata del gene modificato al muscolo scheletrico rimane una sfida significativa. In questo contesto, le piattaforme di veicolazione genica non virali rappresentano un’interessante alternativa ai vettori virali convenzionali, grazie al miglior profilo di sicurezza e alla maggiore biocompatibilità. Tra queste, le nanoparticelle lipidiche (LNP) prodotte mediante tecniche microfluidiche hanno aperto la strada a nuove strategie per un design più efficiente e controllato.
Per rispondere alla crescente necessità di sistemi innovativi di veicolazione di acidi nucleici nella terapia genica, abbiamo sviluppato e caratterizzato, in base alle loro proprietà fisico-chimiche, una libreria di dieci diverse LNP caricate con DNA plasmidico contenente inizialmente un gene reporter per la luciferasi. I test di efficacia biologica condotti sulla linea di mioblasti immortalizzati C2C12 hanno identificato la LNP2 come il candidato più promettente. Successivamente, LNP2 è stata ottimizzata mediante l’applicazione di un rivestimento funzionale di DNA, che ha incrementato in modo significativo le sue prestazioni di delivery rispetto alla versione non modificata.
In una fase successiva, il progetto ha previsto la trasfezione di cellule muscolari primarie isolate dal modello murino distrofico mdx4cv. Queste cellule presentano una criticità intrinseca dovuta al rapido differenziamento, che limita l’ingresso del plasmide nel nucleo. Per superare tale limite, il DNA è stato pre-condensato con solfato di protamina (P*), una proteina che contiene naturalmente un segnale di localizzazione nucleare (NLS). Dopo aver ottimizzato il rapporto in peso tra P* e DNA, è stata quindi sintetizzata e caratterizzata una LNP contenente DNA pre-condensato, denominata P*-LNP2.
Le analisi successive hanno mostrato che la combinazione di DNA pre-condensato con il rivestimento superficiale di DNA ha aumentato in modo significativo l’efficienza di trasfezione della P*-LNP2. Inoltre, le osservazioni mediante microscopia confocale hanno confermato un netto incremento della localizzazione nucleare, risultato cruciale poiché la consegna del materiale genetico al nucleo rappresenta un passaggio fondamentale per la terapia genica in cellule non proliferanti.
Sulla base di questi risultati, è stata sviluppata una formulazione di LNP2 contenente μDys pre-condensata, la quale ha mostrato proprietà fisico-chimiche migliorate ed è stata successivamente testata su cellule muscolari primarie distrofiche. Tale formulazione ha determinato un marcato aumento dell’espressione della proteina distrofina.
Infine, la formulazione P*-LNP2 è stata validata su un modello bioingegnerizzato tridimensionale di muscolo scheletrico distrofico vascolarizzato, denominato ex vivo Muscle Engineered Tissue (X-MET). Il trattamento dell’X-MET con P*-LNP2 non solo ha incrementato i livelli di μDys, ma ha anche migliorato la stabilità del sarcolemma, la funzionalità e la forza contrattile spontanea dell’organoide.
In conclusione, il nostro approccio innovativo basato sull’impiego di μDys pre-condensata all’interno di LNP funzionalmente rivestite ha dimostrato un elevato potenziale nel promuovere l’espressione proteica di μDys nelle cellule muscolari primarie distrofiche e nel modello X-MET. Sebbene le μDys abbiano recentemente evidenziato un’efficacia limitata nel trattamento della DMD, i nostri risultati supportano la prosecuzione delle indagini in modelli in-vivo e forniscono indicazioni preziose per l’ulteriore ottimizzazione di questa piattaforma di veicolazione con altri carichi genetici.