Dottorato in MORFOGENESI E INGEGNERIA TISSUTALE

Titolo della tesi: miRNAs-enriched Trout Embryonic Extracts promote the reversion of the malignant phenotype in liver tumor cells.

RAZIONALE/CONTESTO: L’epatoblastoma (HB) e il carcinoma epatocellulare (HCC) rappresentano rispettivamente i tumori epatici più comuni nei pazienti pediatrici e adulti. La ricerca di nuovi regimi terapeutici in linea con i principi della medicina personalizzata è in corso da decenni e si è intensificata dall’inizio del XXI secolo. Vi è infatti un’esigenza urgente di migliorare e perfezionare i trattamenti standard attuali per ridurre la tossicità e aumentarne l’efficacia. In questo contesto, una delle strategie più promettenti consiste nell’inibire la ricorrenza e la formazione di metastasi fin dal momento della diagnosi, a supporto dell’efficacia degli interventi farmacologici e chirurgici. Il processo di transizione epitelio-mesenchimale (EMT), cruciale nello sviluppo delle metastasi, risulta frequentemente e precocemente attivato sia nell’epatoblastoma sia nel carcinoma epatocellulare. Gli estratti embrionali di pesce hanno dimostrato di aumentare l’efficacia terapeutica nei pazienti affetti da carcinoma epatocellulare e di inibire l’EMT in vitro. Sembra che le miRNA presenti in specifici stadi embrionali del pesce rappresentino i componenti attivi responsabili di questi effetti. OBIETTIVI GENERALI: Gli obiettivi del progetto sono incentrati sull’identificazione degli stadi embrionali della trota iridea (Oncorhynchus mykiss) in grado di esercitare effetti antitumorali sulle cellule di carcinoma epatocellulare. Successivamente, sarà definita una rete molecolare per identificare i fattori coinvolti nella risposta cellulare al trattamento. Infine, sarà chiarito il ruolo delle miRNA contenute negli estratti in relazione agli effetti osservati sulle cellule tumorali. DISEGNO SPERIMENTALE E METODI: Nove estratti embrionali arricchiti in miRNA di trota iridea sono stati testati a tre diverse concentrazioni su cellule HepG2 (epatoblastoma umano) mediante saggi di proliferazione, wound healing, migrazione e invasione transwell. Successivamente, sono state condotte analisi di qPCR e Western blot per caratterizzare gli effetti molecolari degli estratti più attivi, con particolare attenzione ai pathways correlati all’EMT, ai regolatori dell’apoptosi e al metabolismo cellulare. Lo studio è stato esteso per valutare il comportamento invasivo in un modello 3D utilizzando la linea cellulare Hep3B (carcinoma epatocellulare). È stata inoltre effettuata la profilazione dell’espressione di specifiche miRNA oncogeniche e oncosoppressori rilevanti nel cancro del fegato. Infine, sono state caratterizzate le miRNA attive contenute negli estratti per identificarne i potenziali effettori dell’attività antitumorale osservata. RISULTATI: Gli stadi embrionali di O. mykiss compresi tra gastrulazione e neurulazione hanno mostrato un’elevata efficacia nell’inibire motilità, migrazione e invasione cellulare sia nei modelli 2D sia in quelli 3D di epatoblastoma e carcinoma epatocellulare. Coerentemente, le cellule trattate hanno mostrato una riduzione dell’espressione genica e dei livelli proteici di PI3K, così come dei membri delle famiglie SNAIL, TWIST e ZEB, e del marcatore mesenchimale N-Caderina, insieme a un incremento dei livelli proteici di GSK-3β. Inoltre, è stato osservato un potenziamento delle giunzioni serrate, evidenziato dall’aumento dei livelli di E-caderina e dalla sua colocalizzazione con β-catenina alla membrana plasmatica. L’espressione genica di HIF1α è risultata ridotta e i livelli di proteina p53 aumentati. Analisi in corso suggeriscono una modulazione delle miRNA nelle cellule di carcinoma epatocellulare esposte agli stadi embrionali attivi, mirata a chiarire il ruolo delle miRNA derivanti dagli estratti in relazione agli effetti osservati. CONCLUSIONI: Gli stadi embrionali di O. mykiss compresi tra gastrulazione e neurulazione mostrano una significativa capacità di riprogrammare le cellule di carcinoma epatocellulare nei modelli 2D e 3D, con effetti variabili in base allo stadio di sviluppo specifico. Questo studio evidenzia l’abilità degli estratti embrionali di pesce di inibire l’EMT nelle cellule neoplastiche e pone le basi per la caratterizzazione dei loro componenti attivi, con l’obiettivo di chiarire ulteriormente i meccanismi molecolari alla base delle osservazioni precedentemente riportate in vitro e in contesti clinici. Gli estratti embrionali di pesce potrebbero quindi rappresentare potenziali agenti terapeutici aggiuntivi in strategie di trattamento personalizzate per il carcinoma epatocellulare, migliorandone l’efficacia terapeutica.