Dottorato in MORFOGENESI E INGEGNERIA TISSUTALE

Titolo della tesi: Role of Epigenetic and Metabolic Reprogramming in Normal and Neoplastic Hematopoiesis

Razionale: La leucemia mieloide acuta (AML) è una neoplasia aggressiva delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC), caratterizzata da proliferazione incontrollata e blocco della differenziazione. Un raro sottotipo di leucemia promielocitica acuta (APL), guidato dalla fusione PLZF::RARa (ZBTB16-RARA), risulta resistente alle terapie standard come l’acido all-trans retinoico (ATRA) e il triossido di arsenico (ATO). Evidenze recenti hanno messo in luce un’interconnessione essenziale tra il rimodellamento della cromatina e il metabolismo cellulare nella regolazione della differenziazione mieloide, sia in condizioni fisiologiche che patologiche. L’alterazione di queste vie può contribuire alla leucemogenesi e alla resistenza terapeutica, aprendo nuove possibilità di intervento farmacologico. Obiettivo: Chiarire il legame tra l’organizzazione della cromatina e la regolazione metabolica nella mielopoiesi normale e aberrante, con l’obiettivo di identificare nuovi target terapeutici nella AML, indipendentemente dal driver oncogenico primario. Disegno sperimentale e metodi: Sono stati analizzati blasti leucemici di pazienti affetti da PLZF::RARa-APL, PML::RARa-APL, AML e midollo osseo normale (NBM), insieme a una linea cellulare inducibile con ZnSO₄ esprimente PLZF::RARa (U937-B412) e al suo controllo (U937-MT). La respirazione mitocondriale è stata valutata con Seahorse XFe96 Analyzer; i livelli di ROS mediante MitoSOX. L’espressione genica/proteica e gli studi funzionali sono stati condotti tramite Q-RT-PCR, Western blot, immunofluorescenza, co-immunoprecipitazione e Proximity Ligation Assay (PLA). L’attività di miR-223 sulla cromatina è stata analizzata mediante immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) dopo trasfezione con mimic. Apoptosi e proliferazione sono state valutate attraverso il potenziale di membrana mitocondriale (BD™ MitoScreen), l’analisi di caspasi-3/PARP clivate e il saggio MTT. Risultati: I blasti AML mostrano un profilo metabolico flessibile e una capacità mitocondriale aumentata rispetto ai progenitori normali, correlando con una ridotta sopravvivenza dei pazienti. Nella APL associata a PLZF::RARa, la proteina di fusione PLZF::RARa incrementa la respirazione mitocondriale e altera l’equilibrio redox, aumentando i livelli di ROS. A livello meccanicistico, PLZF::RARa forma un complesso nucleare repressivo con NRF2, riduce l’espressione di G6PDH e abbassa i livelli di SIRT1, un regolatore chiave del metabolismo e della cromatina. È stato osservato che miR-223 si associa a regioni cromatiniche che controllano geni metabolici, incluso SIRT1. La perdita di SIRT1 nelle cellule B412 determina un’iperacetilazione di FOXO3a, riducendo la trascrizione di SOD1 e Catalasi, e aumentando la sensibilità allo stress ossidativo. Il trattamento con ascorbato ad alte dosi (un pro-ossidante) induce apoptosi nelle cellule PLZF::RARa+. La combinazione Azacitidina + Ascorbato o Azacitidina + Venetoclax amplifica ulteriormente l’apoptosi e la disfunzione mitocondriale. Conclusioni: Lo studio identifica: 1. Un ruolo cruciale della riprogrammazione metabolica nella biologia dell’AML, in quanto elemento chiave nel mantenimento del fenotipo leucemico; 2. Una vulnerabilità redox nelle cellule PLZF::RARa+, dovuta al deficit dei sistemi antiossidanti. Questi risultati suggeriscono che il targeting dei pathway metabolici e redox rappresenta una strategia terapeutica promettente per questo sottotipo di AML resistente ai trattamenti convenzionali.